Authors have nothing to disclose.

動物実験、根拠や研究の目的を実行するためのプロトコルは、南カリフォルニア機関動物実験委員会の大学から提出され、承認された。 デ·同定されたヒト食道切除標本から初代培養を確立するためのプロトコルは、南カリフォルニア大学倫理委員会で承認されました。 1.マウスまたはヒト食道を入手<ol><li> マウス食道を取得します。 <ol><li>頸椎脱臼に続いて2％イソフルラン吸入過剰摂取で8〜12日齢のマウスを安楽死させる。 </li><li>上下に面する腹動物を固定し、70％エタノールで腹側表面を濡らす。鉗子で、つかみ、ピンセットで尿道口に皮膚の前方を持ち上げる。あごに尿道口から腹側正中に沿って切断するための標準的なストレート外科用ハサミを使用してください。皮膚のみをカットするように注意してください。&lt;/ LI&gt; <li> &quot;Y&quot;逆さまを形成する、動物の両側の膝に下向きに開いて尿道から切開を行います。胸郭に沿って動物の両側に別の切開を行います。 </li><li>慎重に根本的な腹膜と胸郭のオフを、両側の皮をはがし、そして両側に横たわっていた。胸腔と腹腔の上にある腹膜の上にある胸郭を調べます。 <ol><li>鉗子で腹膜を持ち上げ、横隔膜と肋骨ケージにそれをカットアップ、腹部の内容への損傷を防ぐために上向きにハサミを指している。静かに、肝臓の左葉を持ち上げ、基礎となる胃、食道·胃接合部と食道の腹部部分を露出させる。 </li></ol></li><li>子宮頸ガードルまでの正中線に沿って胸骨と肋骨を切断するためにオートクレーブ処理外科用ハサミを使用してください。胸部内容への損傷を防ぐために上向きにハサミを向け。完全に内容を公開する両側に胸郭を引いて胸腔。 </li><li>静かに心臓や肺の両葉を取り除く。 Q-ヒント過剰な血液を吸収する。胸部食道は胸椎に気管と前の後方に横たわって狭い、フレキシブルチューブです。 NOTE：食道、マウス新生児識別することは困難である。食道·胃接合部のローカライズは、食道の識別は簡単になります。 </li><li>慎重に周囲の血管系、脂肪を解剖、胃から食道をフォローアップし、子宮頸キャビティ内の食道の原点までのすべての方法を腸間膜。鈍い先端を有する外科用ハサミは、この目的のために最適に動作。 </li><li>食道の全長を切除し、以下に説明するさらなる処理のためにハンクス平衡塩溶液（HBSS）中に置く。必要に応じて、方向付けのために胃の一部を削除します。 注：小さな組織サイズのため、筋肉から固有筋層の分離粘膜は、マウス新生児食道達成できないし、全体の食道は、下記の処理が行われる。 </li></ol></li><li> 人間の食道を取得します。 <ol><li> HBSSで食道切除標本（典型的には、5 cm以下）を洗って接続されているすべての結合組織、脂肪、または血管系を削除します。 </li><li>標本の一部を切除し、必要に応じて将来の組織学的検査のためにホルマリン中に置く。 </li><li>鋭い切開によって、基礎となる固有筋層から残りの粘膜を分離する。 </li><li>サブセンチフラグメントおよび以下に記載されているプロトコルの対象に粘膜をカット。 注：ヒト食道切除は、後述する処理の前に、最大6時間、PBS中で保存することができる。食道標本の供給源は、試料サイズが決まると実験依存することになる。 </li></ol></li></ol> 2.アイソマウスおよびヒト食道間質細胞<ol><li> fは食道の間質細胞を単離する機械的および酵素消化の組み合わせにより、ROMのマウスおよびヒト組織。 <ol><li>機械的にHBSSではさみと複数回の洗浄で組織を切り刻むことでダイジェスト。酵素的に300 U / mlのコラゲナーゼXIおよび0.1mg / 25分（マウス組織）のために、または最大6時間（ヒト組織）mlのディスパーゼで組織をインキュベートすることにより、ダイジェスト。ミンチに使用する器具はオートクレーブし、滅菌されていることを確認します。 NOTE：コラゲナーゼは、コラーゲン、一緒に動物組織を保持する責任細胞外マトリックスタンパク質を分解する酵素である。コラゲナーゼXIは、高いコラゲナーゼ活性を有しており、この分離プロトコルの成功を見ている。ディスパーゼは、細胞膜活性を保持し、二次酵素としてコラゲナーゼと組み合わせて使用​​される穏やかなタンパク質分解解離活性を有する細菌酵素である。 </li><li> HBSSを含む、それぞれ1.7ミリリットルマイクロ遠心または5 mlチューブでマウスまたはヒト組織から得た粘膜の断片を置きます。さらに組織をみじん切りそれぞれのチューブに収まるオープン先端幅とハサミを使用して2〜3ミリメートル片に。食道粘膜の断片は、チューブの底に沈殿さを可能にするために十分な時間を確保してください。 </li><li>ゆっくりと不注意に組織を破棄しないように注意しながら、HBSSをデカント。穏やかに振とうすることにより、以下の新鮮なHBSSで交換してください。別の方法として、1ミリリットルピペットでHBSSを削除します。 </li><li>穏やかに食道断片は、各洗浄の間に沈降する時間を得るための洗浄の間で振とうしながら、このように8回の合計を組織を洗ってください。 注：ヒト組織は、よりその新生児のマウス組織を刻みが必要になります。 </li></ol></li><li> 300 U / mlのコラゲナーゼXIし、室温で低速でロッキングシェーカーセットで25分間0.1 mg / mlのディスパーゼを有するマウス組織をインキュベートする。 <ol><li>室温で低速に設定したロッキングシェーカー上、最大で6時間300 U / mlの第XIコラゲナーゼ及び0.1 mg / mlのディスパーゼでヒト組織をインキュベートします。 注：人間esophaの可用性GUSは可変である。初代培養の成功した世代で最大6時間の結果のための酵素とインキュベートしたヒト食道粘膜。 </li></ol></li><li>酵素消化した後、10分間200×gではさみや遠心分離機とのさらなるミンチ組織。 </li><li>上清を捨てる。非生存細胞および破片を除去するために、2％ソルビトールを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で5回の5mlチューブに混合細胞懸濁液からなるペレットを移し、洗浄する。 </li><li> 10％ウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM中で6ウェルプレートに、培養中の種子細胞、10mg / mlのインスリン、10μg/ mlのトランスフェリン、10μg/ mlのゲンタマイシン、および2 / mlの上皮成長因子（EGF） 。真空フィルター（0.22μm）で濾過した後に添加することができるEGF以外のすべてのコンポーネント。切除サイズに応じて、複数の6ウェルプレートの中で人間の切除標本から得られた細胞を分配する。 </li><li>井戸が80％コンフルエントになったら、T25への通路接着細胞は私たちをフラスコる0.05％トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）。 400×gでメディアやスピンで中和。 <ol><li> 1：1の比率でのT25フラスコ、継代細胞に6ウェル通過のため。 2または1：3の比率コンフルエントT25フラスコ1に継代することができる。 1の比率：T75フラスコにT25フラスコから通路に、1を使用。関係なく、容器の2〜3日おきにメディアを変更します。 </li><li>メディアは、上述の筋線維芽細胞において、加湿5％CO 2インキュベーターと培養液中で37ºCで細胞を増殖させる。 注：上皮細胞はこれらの培養または継代条件下では生存しない。特徴づけのために、以下に記載の研究に用いた細胞は、継代5と15の間である。 </li><li>筋線維芽細胞の培地に10％ジメチルスルホキシドを添加することにより、液体N 2中で細胞を凍結保存する。 </li></ol></li></ol> 3.特徴付けマウスおよびヒト食道間質細胞<ol><li>倒立顕微鏡で細胞の形態を調べます。紡錘形を守って接着性細胞の形態（ 図1）。 </li><li> α-SMA、ビメンチン、デスミン、およびサイトケラチン：以下の細胞骨格のマーカーを評価することによって培養細胞を特徴づける。筋線維芽細胞様の表現型との間質細胞は、α-SMAおよびビメンチン（ 図2）細胞骨格筋線維芽細胞マーカーを発現する。 <ol><li>さらにデスミンための免疫染色筋細胞から培養された間質細胞を区別する。培養細胞での免疫染色を行うために、4ウェルチャンバースライド中で1.5×10 4個の細胞をプレーティングし、24時間、筋線維芽細胞の培地中で成長する。筋線維芽細胞様の表現型との間質細胞が弱いか存在しないデスミンの発現を持つことになります。間質細胞は、上皮マーカーパンサイトケラチンの発現を欠く（データは示さず）。 注：培養物の評価は、フローサイトメトリー、免疫細胞化学及び細胞表面マーカーによる細胞骨格マーカーの評価を含む。免疫細胞化学は、元のように特性化の主な方法として使用されている細胞骨格タンパク質のPRESSIONプロファイルは、線維芽細胞、筋線維芽細胞や筋細胞のためにユニークです。フローサイトメトリーは、上皮、内皮および造血細胞マーカーの細胞表面発現を評価することにより、培養純度を確立します。 CD90は​​、それがヒト線維芽細胞および筋線維芽細胞の両方で発現されるヒト間質細胞を同定する補助的方法として有用である。それはまた、マウスT細胞によって発現されるCD90は​​、マウス間質細胞の特徴付けに有用ではない。 </li></ol></li><li>細胞が60％コンフルエンスに達した後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でスライドをリンスし、メタノールで固定する。 -20℃で10分間、メタノール中で細胞をインキュベートし、その後、使用するまで4℃でPBS中に保存する。 </li><li>標準の免疫染色プロトコルに従ってください。 </li><li>簡単に言えば、一次抗体を適用する前、PBS中の5％goatserumで固定した細胞をブロックする。同様に、5％ヤギ血清で一次および二次抗体を希釈します。 <ol><li> α-SMAおよびビメンチンの検出のために、使用する以下の抗体および濃度：マウスmAbは、α-SMAを次のように1：500希釈：1でのビメンチンに250希釈し、ウサギたpAB。 </li><li> 1の希釈で200およびCy2とコンジュゲートヤギ抗ウサギ：PBSで3回洗浄し、1の希釈で二次抗体ローダミン結合ヤギ抗マウスを追加し、4℃で一晩室温で一次抗体と共にインキュベートし、1時間1,000室温で。 </li><li>次に、対比の1分間に1μg/ mlの濃度で4核 &#39;、6-ジアミジノ-2Phenylindole（DAPI）およびPBSで洗浄した。倒立顕微鏡でスライドを分析します。 </li></ol></li><li>造血のためのマウスおよびヒトの食道細胞の検査（CD45）およびフローサイトメトリーによる内皮細胞（CD31）の細胞表面マーカー（ 図3）によって、培養物の純度を確立する。間質細胞表面マーカーCD90の発現によって、ヒト細胞を特徴づける。 NOTE：CD90は​​、マウスTセルネズミ間質細胞を同定するために使用することができないLSはまた、CD90を発現する。 <ol><li> 10分間37℃で非酵素的細胞解離溶液で処理することにより培養フラスコから培養マウス食道の間質細胞を切り離し、二回FACS緩衝液で洗浄し、関連するアイソタイプコントロールでFITC-CD45およびAPC-CD31を用いて計数し、染色し、従っ標準染色手順に。 </li><li> FACSキャリバーを用いて細胞を収集し、FlowJoソフトウェアを使用してデータを分析する。細胞を染色する前に、抗体を最適化し、アイソタイプ対照、正常マウスの脾臓および骨髄細胞を用いて濃度を滴定する。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+stromal+stem+cells+in+tissue+regeneration+and+wound+repair.">The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair.</a> Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).</li><li>Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cells+of+the+intestinal+lamina+propria.">Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria.</a> Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).</li><li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Helper+2+Cytokines,+Transforming+Growth+Factor+beta1,+and+Eosinophil+Products+Induce+Fibrogenesis+and+Alter+Muscle+Motility+in+Patients+With+Eosinophilic+Esophagitis.">T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis.</a> Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+cells+important+in+health+and+disease.">Paracrine cells important in health and disease.</a> The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+subepithelial+myofibroblasts.">Intestinal subepithelial myofibroblasts.</a> The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).</li><li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cells+participate+in+the+murine+esophageal+mucosal+injury+response.">Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).</li><li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epimorphin+deletion+protects+mice+from+inflammation-induced+colon+carcinogenesis+and+alters+stem+cell+niche+myofibroblast+secretion.">Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).</li><li>Kalabis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mouse+and+human+esophageal+epithelial+cells+in+3D+organotypic+culture.">Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture.</a> Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).</li><li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue.">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li><li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastroesophageal+reflux+disease-associated+esophagitis+induces+endogenous+cytokine+production+leading+to+motor+abnormalities.">Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities.</a> Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).</li></ol>

この作品は、NIH / NCI K08CA153036-01A1（AS）、健康のAGA-ゼネラル·ミルズベル研究所ガット生理学と健康で栄養研究員賞（AS）とライト財団パイロット賞（AS）によってサポートされています。

組織のサイズに適合さミンチ消化時間で、マウスまたはヒト組織を使用するときに初代培養生成のための技術は、一般的に類似している。マウス組織での経験は、上記の方法を使用して一貫して一次培養物の確立に成功をもたらすことを示唆している。プロトコル内の重要なステップは、手術器具の滅菌を含む組織培養の標準的な滅菌技術に従って。マウスの年齢も重要なステップです。 8?...

上皮-間質相互作用は、粘膜の再生、修復、線維症、および発癌1,2-含む胃腸管の様々な機能の調節に関与する。これらの相互作用は、最高の小腸および結腸において研究されており、同様に食道粘膜障害3において役割を果たし得る。腸および結腸の間質細胞と呼ばれる筋線維芽細胞の亜集団は、組織損傷、炎症の媒介に関与し、4,5を修復することが実証されている。遠位の胃腸管では、これらの紡錘形細胞が上皮及び固有層の間の界面での基底膜に隣接して配置されており、α-SMAおよびビメンチン陽性の、汎サイトケラチン陰性、及び弱陽性またはデスミン陰性5として定義される。 食道ストロマ厳密セルラーまたは分子レベルで特徴付けられていない。ネズミの食道における私たちの仕事は、デを持って扁平上皮6に時折下にある、食道間質におけるα-SMAおよびビメンチン細胞monstrated。上皮-間質相互作用は、そのような胃食道仲介傷害6と好酸球性食道炎3として食道粘膜障害に関係している。線維性狭窄はまた、胃腸線維症の病因に関与していた食道の傷害および間質細胞の既知の合併症である。これらの細胞の単離は、錯乱シグナル伝達経路を調査するために必要な研究を達成するの​​に役立ちます。 この投稿は、これらの相互作用を媒介するシグナル伝達経路に関する知識の既存のギャップに対処することができるように、α-SMA陽性の、ビメンチン陽性の筋線維芽細胞の初代培養を確立するために必要な技術を提供する。記載された技術が正常初代マウス結腸筋線維芽細胞7及びfurtheを確立するために、著者らによって使用されているRは、マウス6と人間の筋線維芽細胞のような食道間質細胞の確立のために適合した。 】ここで我々は、将来の機能研究に使用する前に、マウスまたはヒト食道から確立これらの培養を確立し、特徴づけるために必要な条件について説明します。培養物を増殖させ、最大で15継代のために利用することができる。以下に概説する方法を経由して一次培養物の単離と確立は、筋線維芽細胞表現型を有する間質細胞を生成します。 、正のビメンチン-SMA、α、および​​デスミン弱陽性または陰性、及びサイトケラチン陰性であった。この表現型は3負または粘膜筋板6のα-SMA陽性の、ビメンチン陰性表現型α-SMA、主にビメンチン陽性である食道線維芽細胞の表現型とは区別される。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1647">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:549px;">Name</td>
			<td style="width:549px;"></td>
			<td style="width:549px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H6648</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dispase&#160;</td>
			<td>GIBCO, Invitrogen</td>
			<td>&#160;17105-041</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">collagenase XI&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>C9407&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM&#160;</td>
			<td>GIBCO, Invitrogen&#160;</td>
			<td>11965-092</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sorbitol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma)</td>
			<td>F42442</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">transferrin&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10-652-202-001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trypsin/EDTA&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-052-Cl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">epidermal growth factor&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9644</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trypsin/EDTA&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;25-052-Cl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reagents for immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse mAB to &#945;-SMA&#160;</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab7817</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit pAB to vimentin&#160;</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab45939</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cy2 conjugated Goat anti Rabbit&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-225-144</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI&#160;</td>
			<td>sigma-aldrich</td>
			<td>D8417</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD31 conjugated to eFluor 450&#160;</td>
			<td>ebiosciences</td>
			<td>48-0319-410</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CD90 conjugated to APC&#160;</td>
			<td>ebiosciences&#160;</td>
			<td>17-0909-41&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Annexin V and 7AAD&#160;</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>559763</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse Fc block for CD16/CD32&#160;</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>2136662</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5 ml tube&#160;</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>30108310</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Motic AE31 inverted microscope</td>
			<td>Motic AE31 inverted microscope</td>
			<td>Motic AE31 inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators</td>
			<td>Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators</td>
			<td>Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-well chamber slides&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>177437</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eppendorf Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5810R</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Olympus Vacuum-Driven Filter System&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>25-227</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope (Tokyo, Japan)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 well plates&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T25 Flasks&#160;</td>
			<td>TRP&#160;</td>
			<td>90026</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T75 Flasks&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>43064</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dissection Scissors</td>
			<td>Dissection Scissors</td>
			<td>Dissection Scissors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection Forceps</td>
			<td>Dissection Forceps</td>
			<td>Dissection Forceps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Single Tipped Q-Tips&#160;</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>540500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T75 Flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>43064</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Metamorph software (Molecular Devices)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FACSCAlibur&#160;</td>
			<td>BD Bioscience&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FACSVerse</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of myofibroblasts from mouse and human esophagus

マウスおよびヒト食道筋線維芽細胞は、酵素消化を介して生成されます。新生児（8-12日齢）マウス食道は、収穫みじん切り、洗浄し、そして25分間、コラゲナーゼおよびディスパーゼによる酵素消化に供される。人間の食道切除標本は、固有筋層と外膜を剥奪され、残りの粘膜はミンチされ、最大6時間、コラゲナーゼとディスパーゼとの酵素消化にかけた。培養した細胞は、α-SMAおよびビメンチンを発現させ、全く弱いかデスミンを発現する。培養条件は、上皮、造血、または内皮細胞の成長に貢献しない。培養物の純度は、さらに潜在的な汚染造血および内皮細胞の細胞表面マーカー発現のフローサイトメトリー評価によって確認される。記載された技術は、簡単であり、非hematopoieitc、非内皮間質細胞の一貫した生成をもたらす。この技術の制限事項の使用に固有のものである分子生物学の研究で初代培養、 すなわち 、避けられないばらつきが異なるマウスまたはヒトを越えて確立の文化の中で発生しました。初代培養は、しかし細胞株に比べて、生体内の状態をより代表反映している。これらの方法はまた、群間の比較を可能にする、研究者に異なる臨床および実験条件からストロマ細胞を単離し、培養する能力を提供する。特徴付け食道間質細胞はまた、食道疾患における上皮 - 間質相互作用を調査する機能的研究に用いることができる。

機械的および酵素消化を用いて単離し食道間質細胞は、最初に6ウェルプレートに播種し、培養する。めっき時間以内に倒立顕微鏡を用いた細胞の検査は、プレート底部（ 図1A）に緩く付着混合細胞懸濁液を実証する。次の24時間にわたり、プレート底部にしっかりと付着した紡錘状の細胞は、細胞がウェル内の5日間の全領域をカバーし、形態を維持し、正常に継代することがで?...

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Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express &#945;-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

マウスおよびヒト食道から筋線維芽細胞の単離

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

10.9K ビュー.  Keck School of Medicine, University of Southern California. We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express α-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions. 

ビデオ: Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails

マウスの尾からのゲノムDNAの単離

生物学

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

ヒト皮膚から大人上皮幹細胞の単離と培養

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult stem cells from liposuctioned adipose tissue that they initially termed Processed Lipoaspirate Cells or PLA cells. Since then, these stem cells have been renamed as Adipose-derived Stem Cells or ASCs and have gone on to become one of the most popular adult stem cells populations in the fields of stem cell research and regenerative medicine. Thousands of articles now describe the use of ASCs in a variety of regenerative animal models, including bone regeneration, peripheral nerve repair and cardiovascular engineering. Recent articles have begun to describe the myriad of uses for ASCs in the clinic. The protocol shown in this article outlines the basic procedure for manually and enzymatically isolating ASCs from large amounts of lipoaspirates obtained from cosmetic procedures. This protocol can easily be scaled up or down to accommodate the volume of lipoaspirate and can be adapted to isolate ASCs from fat tissue obtained through abdominoplasties and other similar procedures.

In 2001, researchers at UCLA described the isolation of a population of adult stem cells, termed Adipose-derived Stem Cells or ASCs, from adipose tissue. This article outlines the isolation of ASCs from lipoaspirates using a manual, enzymatic digestion protocol using collagenase.

人間の脂肪吸引物からの脂肪由来幹細胞を手動で隔離

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

マウスおよびヒト結腸組織からの一次筋線維芽細胞の分離

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

マウス抵抗動脈から毛細血管内皮の管の隔離

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

成体マウス切歯から歯科上皮幹細胞の単離および培養

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

ヒト血清から小非コードRNAの分離

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウスの骨格筋の最小量からミトコンドリアの単離

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

新生児および成人マウス皮膚由来の初代マウスケラチノサイトの単離および培養

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

成人心臓線維芽細胞と筋線維芽細胞の分離と特徴付け

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...