我々は、財政的に酸化ストレスの研究を支援するため、トリーゼンリヒテンシュタイン、LHW財団に感謝したいと思います。

バーゼル大学で行わコメットアッセイの研究は、眼科学科はバーゼルの現地倫理委員会によって承認されました試薬の調製<ol><li>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（カルシウム++、Mg ++を無料）をPBS（1 Lパケット）とメディアへのdH 2 Oの990ミリリットルを追加することにより、溶液を調製します。 pHを7.4に調整します。室温で保管してください。 </li><li>溶解液を調製：1,000ミリリットルのdH 2 O中の2.5MのNaCl（146.1グラム）、100mMのEDTA（37.2グラム）および10mMのTrizma塩基（1.2グラム）を追加準備するには</li><li> 1500ミリリットルのdH 2 Oに10 M NaOHを30ミリリットルと7.5ミリリットルの0.2M EDTA、適量を添加することにより、電気泳動緩衝液（300mMのNaOHを/ 1mMのEDTA）を調製し、よく混ぜます。総容量は、ゲルボックス容量に依存します。使用前に、&gt; 13のpHを確保するために、緩衝液のpHを測定します。 </li><li> 0.4 Mトリスを含む中和バッファーを準備します（＆＃濃縮（48.5 gmは〜800ミリリットルのdH 2 Oは、7.5にpHを調整するために追加されました）62; 10 MのHCl）をdH 2 Oで千ミリリットルでこの溶液を室温で保管してください。 </li><li>染色溶液を調製します。臭化エチジウム（EtBrを、10倍の株価、20 / mlの）に室温で50ミリリットルのdH 2 Oおよび店舗でのEtBr 10mgを追加します。 1X株式の- 9ミリリットルのdH 2 Oで1ミリリットルを混ぜます慎重な！それが知られている発がん性物質であるように、適切な予防措置とのEtBrを処理します。 </li></ol>白血球の2の単離<ol><li>静脈穿刺を用いてヘパリンなどの抗凝固剤を用いたヒト血液サンプル（20ml）で取得します。 </li><li>このようなヒストとして密度勾配細胞分離器を用いてリンパ球を分離します。 <ol><li> （FBSなし）PBSまたはRPMIで1の割合と層600の上にμlの細胞分離液：簡単に言うと、1に血液を希釈。 </li><li> 4℃で20分間遠心操作し1,800×gで。 PBS / RPMI 3〜5mlのに「バフィー」のコートを吸引し、リンパ球をペレット化し、10分間300×gで遠心分離しました。 </li><li>ただPBS（RPMIとの境界上からリンパ球を取得ピペッターを使用して）および細胞分離液。プラズマと各チューブの細胞分離液層の間の界面からの白血球バンドを外し、1 50mlチューブに集めます。 </li></ol></li><li>冷ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で50mlに全量を。 10分間、300×gでDMEMで細胞懸濁液を3回洗浄します。 </li><li>血球計数器を用いて、細胞の合計数をカウントします。 PBSで細胞を懸濁し、10 7細胞/チューブでマイクロ遠心チューブに等分。 </li><li>ピペットで5ミリリットル使い捨てプラスチックチューブへの細胞の0.4ミリリットル。 40℃で1.2ミリリットルの1％低ゲル化温度アガロースを追加します。混合し、迅速かつプレコートスライドのアガロースで覆われた表面上に細胞懸濁液1.2mlのをピペット。泡を生成することは避けてください。 </li><li>アガロースは、約2分間、ゲル化することができます。ゲル化のために使用される時間と温度と一致すると、そのアガロースが完全に溶解液に浸す前に設定されていることを確認。完全秒後らは、〜4ºCで溶液を溶解することに水没します。 </li></ol> 3.溶解および電気泳動注：記載された手順は、pH&gt; 13のアルカリ性条件下での電気泳動のためのものです。 <ol><li> 〜4ºCで少なくとも2時間後、静かに溶解液からスライドを削除します。場所はできるだけ一緒に近く、それらを滑り、一方の端部付近の水平ゲルボックスに並んでスライドします。 </li><li>液面が完全にスライドを覆うまで（アガロース上の泡を避けるため）焼きたてのpH&gt; 13電気泳動バッファーでバッファ貯水池を埋めます。 </li><li>スライドは、DNAとアルカリに不安定な損傷の発現の巻き戻しを可能にするために20分間、アルカリ性緩衝液に座ってみましょう。 </li><li> 25ボルト（〜0.75 V / cm）での電源をオンにして、上昇又はバッファレベルを低下させることにより、300ミリアンペアの電流を調整。 30分間スライドを電気泳動。 </li><li>電源をオフにします。静かバッファおよびpからスライドを持ち上げますドレイントレイのレース。賢明なコートを中和バッファーでスライドを削除します。スライドは、少なくとも5分間座ってすることができます。スライドを排出し、さらに2回繰り返します。 </li><li> 80μlの1×臭化エチジウム（EtBrを）でスライドを染色し、5分間放置した後、余分な汚れを除去するために冷却した蒸留水に浸し。その後、スライド上にカバースリップを置き、それらをすぐに保存します。ストアは、乾燥状態で室温で月にスライドします。 注：他のDNA染色（ 例えば 、SYBR緑）を用いてもよいです。注意！ほとんどの色素は変異原性であるように、保護手袋を着用します。 </li></ol> DNA切断の4定量<ol><li> DNA損傷を可視化するために、40倍対物レンズ蛍光顕微鏡下でのEtBr染色DNAのスライドを観察します。 </li><li> DNAの移動および移行DNA（ 図1A）の割合の長さを測定することにより定量的に細胞内のDNA損傷を評価します。 Tail-モーメントとオリーブMOMEによるDNA損傷（ 図1B）を定量化しますNT。テールモーメントとオリーブ-Momentの定義は、以前8-10を与えられています。 注：我々の経験では、それはパラメータの一つによって固執するのに十分です。細胞は、顕微鏡スライドや写真細胞上でスキャンする自動化ツールを設定することで、撮影されています。 DNA切断の定量化は、画像解析ソフトウェアパッケージによって行うことができます。カスタムセルの画像をキャプチャし、DNA損傷を定量化するために作られているいくつかの異なるソフトウェア·パッケージがあります。我々は、実験を通して同じソフトウェアパッケージを使用することをお勧めします。ラボの技術者は、無傷の細胞または彗星は、コンピューターで採点されるように識別し、その上にマウスでクリックします。彗星または無傷の細胞は、その後、自動的に採点されます。 </li></ol>

<ol>
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P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells).">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells).</a> Exp Cell Res. 175, 184-191 (1988).</li><li>Gaiv&#227;o, I., Sierra, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+comet+assay:+insights,+uses,+and+future+perspectives.">Drosophila comet assay: insights, uses, and future perspectives.</a> Front Genet. 5, 304 (2014).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+in+lens+epithelial+cells+and+peripheral+lymphocytes+from+age-related+cataract+patients.">DNA damage in lens epithelial cells and peripheral lymphocytes from age-related cataract patients.</a> Ophthalmic Res. 51 (3), 124-128 (2014).</li><li>Huet, S. A., Vasseur, L., Camus, S., Chesn&#233;, C., Fessard, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+comet+and+micronucleus+assays+in+metabolic+competent+HepaRG+cells+to+predict+in+vivo+genotoxicity.">Performance of comet and micronucleus assays in metabolic competent HepaRG cells to predict in vivo genotoxicity.</a> Toxicol Sci. 138 (2), 300-309 (2014).</li><li>Danson, S., Ranson, M., Denneny, O., Cummings, J., Ward, T. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+and+reduction+of+comet+assay+variation+in+relation+to+DNA+damage:+studies+from+the+European+Comet+Assay+Validation+Group.">Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group.</a> Mutagenesis. 25, 109-111 (2010).</li><li>Chan, S. W., Chevalier, S., Aprikian, A., Chen, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+quantification+of+mitochondrial+DNA+damage+and+copy+number+in+circulating+blood:+a+sensitive+approach+to+systemic+oxidative+stress.">Simultaneous quantification of mitochondrial DNA damage and copy number in circulating blood: a sensitive approach to systemic oxidative stress.</a> BioMed Res Int. , 157-547 (2013).</li><li>Sanchez-Quesada, J. L., Perez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+lipoproteins+as+biomarkers+of+cardiovascular+risk+in+diabetes+mellitus.">Modified lipoproteins as biomarkers of cardiovascular risk in diabetes mellitus.</a> Endocrinol Nutr. 60, 518-528 (2013).</li><li>Gandhi, G., Kaur, G., Nisar, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+case+control+study+on+genetic+damage+in+individuals+residing+in+the+vicinity+of+a+mobile+phone+base+station.">Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station.</a> Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).</li><li>Cabarkapa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+dry+olive+leaf+extract+in+adrenaline+induced+DNA+damage+evaluated+using+in+vitro+comet+assay+with+human+peripheral+leukocytes.">Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes.</a> Toxicol In Vitro. 28 (3), 451-456 (2014).</li></ol>

スウェーデンの科学者Ostlingとヨハンソンは、セル1におけるDNA損傷を定量化するためにコメットアッセイを使用して、そのフィールドの最初でした。中性条件は、二つの科学者が使用することが、唯一の二本鎖DNA切断の検出を可能にしました。シンらは 、後に二本鎖および一本鎖DNA切断を評価し、アルカリに不安定な部位12を検出することができる敏感なバージョンを生成し、アルカリ条件下で使用するためのアッセイを、適 ​​応しました。その初期の開発以来、このアッセイは、異なる細胞タイプ13-15におけるDNA損傷の種類を評価するために好適にするために様々な段階で修飾されています。 すべての技術と同様に、技術的な詳細に厳密な注意を払うことは、正確な結果16を得ることが重要です。すべての方法論的段階からの溶液製剤彗星への専門家の実験室TECHNによって実行される定量化は、されている場合は、私たちの経験に基づいて、最良の結果が得られていますicians。新鮮で正しく準備されたメディア、適切なピペッティング技術、正確なタイミングと新たに調製した白血球の（以前は結果の項で述べたように）使用の使用は、正確な結果17を得るために溶解し、ゲル電気泳動ためには不可欠です。 このアッセイのすべての個々のステップは、信頼できる結果を得るために等しく重要である。彗星定量まで溶液調製から一つ一つの方法論的なステップは、専門家の研究室によって実行された場合、一般的に最良の結果に16が得られる新鮮で正しく準備されたメディアの使用を思わtechnicians.Important 、適切なピペッティング技術、正確なタイミングとは、すでに結果セクションアッセイ17から適切な結果を得るために溶解し、ゲル電気泳動のために新たに調製した白血球の使用にいいます。 他の方法がそうであるように、コメットアッセイ技術は、アドバンがありますtagesと欠点。感度の高い方法であることは、このアッセイは、DNA切断を増強するため、結果に影響を与える可能性のある要因（ 例えば、UV光）に対して脆弱です。研究されていることを除いて、酸化的ストレスを高めることができる任意の要因は、避けるべきです。ストレッサーは、白血球ではなく、他のすべての血液媒体およびリンパ球だけでなく、酸化ストレスのレベルを上げることができます。前述したように酸化ストレス18,19の測定多くの異なる、より直接的な方法があります。コメットアッセイは、特定の利点を有している多くの方法の一つです。これらは、その比較的低いコストを含む、少数の細胞は、必要な（&lt;10,000細胞）、したがって、患者ごとに必要な少量の血液サンプル、細胞（約3日）におけるDNA損傷を定量化するのに必要な時間の比較的短い期間、その感度異なる細胞型におけるDNA損傷を査定するために、その広範な適用性。私たちはこの経験を持っていたので、過去には、我々は、白血球で動作するように選択します細胞型、それが計画された特定の研究に適用しました。コメットアッセイの別の利点は、異なるタイプおよびDNA損傷のレベルを検出するために使用することができ、そのようなDNA修復試験、補足試験または遺伝毒性試験などの酸化ストレスに加えて研究の様々な他の分野に適用することができることです。 酸化ストレスは、現在、複数の疾患の病因に重要な役割を果たしていると認識されます。コメットアッセイ法は、酸化的ストレス18,19を測定する多くの方法のうちの1つが、比較的単純な汎用性と安価です。習得した場合、この方法は、酸化ストレスが役割8-10,20,21を果たしている医学のすべての領域で使用することができます。

コメットアッセイは、最初にスウェーデンの科学者Ostlingとヨハンソン1によって開発されました。 DNAは負に荷電した分子です。電気泳動の間、小さく、損傷を受けたDNA断片は、正に荷電したアノード2に向かって速く移動します。 DNA断片が小さいほど、陽極に向かってより速くそれらの移動は、無傷の、損傷を受けていないDNAおよび損傷DNA断片3からなる「尾部」からなる「ヘッド」の典型的な「コメット」を形成します。損傷を受けたDNAは5 DNA切断の発生はかなりバランスの維持本体4内の異なるメカニズムによって修復することができます。しかし、バランスがDNA切断に賛成している場合は、ブレークは蓄積することができ、最終的に疾患の発展に貢献します。 私たちのDNAは、与えられた時間6で約0.000165パーセントのダメージを受けます。一本鎖DNAの切断は、DNA二重らせんの2本の鎖のうちの1上の欠陥を参照してください。DNA二重らせんの両方の鎖が破損しているときに、二本鎖DNA切断が発生しているのに対し。このような細胞の年齢、タバコの煙、様々な薬物や酸化ストレス7-9として与えられた時点でのDNA切断の量を高めることができる様々な要因があります。強化されたDNA切断につながるすべての要因が一定に保たれる場合には、コメットアッセイによるDNA切断の定量化は、酸化ストレスの良い間接的なパラメータです。 コメットアッセイの方法は、眼科学などの医学でますます、今日使用されています。この理由の1つは、酸化的ストレスは、より多くの種々の疾患8-11及びコメットアッセイの発症メカニズムとして認識さは酸化ストレスを間接的に定量化することが可能な1つの方法であることです。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>(CPW59)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium EDTA</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM1370)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(E-8751)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(1077-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(TS1006)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Ranbaxy Rankem</td>
			<td>(S0160)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>BDH-Merck</td>
			<td>(89021)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM 845)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Spectrochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials required for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Melting Agarose (NMA)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM273)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Point Agarose (LMPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(A9414)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol - Qualigens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm)</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>(500010)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor and Tips</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comet assay as an indirect measure of systemic oxidative stress

高等真核生物は酸素なしで生きることはできません。まだ、逆説的に、酸素は、それらに有害であることができます。それは別のπ*反結合軌道にある2つの不対電子を有するので、酸素分子は、化学的に比較的不活性です。これらの2つの電子が、彼らは自分自身の軸の周りに同じ方向に回転するという意味、平行スピンを持っています。酸素分子は非常に反応しないのはこのためです。酸素の活性化は、二つの異なるメカニズムによって発生することがあります。いずれかの時間（一価の減少）で一つの電子を介して還元により、または十分なエネルギーの吸収による不対電子のスピンを反転させます。これは、反応性酸化種（ROS）の産生をもたらします。人間の体は、その生理学的状態のROSを排除するいくつかの方法があります。 ROS生産は修復能力、酸化ストレスの結果と被害の異なる分子を超えた場合。酸化ストレスは私することのできる多くの異なる方法が存在しますasured。この原稿はまた、DNA切断の測定を可能にする「コメットアッセイ」として知られている細胞ゲル電気泳動、名前のメソッドのいずれかに焦点を当てています。酸化的ストレスの他のDNA損傷を引き起こすことが知られているすべての要因が一定に保たれている場合、コメットアッセイによって測定したDNA損傷の量は、酸化ストレスの良好なパラメータです。原理は単純であり、DNA分子は負に帯電しているという事実に依存します。無傷のDNA分子は、電気泳動中に移動しないような大きなサイズを有します。 DNA切断が、陽極に向かって電界内を移動より小さな断片に存在する結果であれば。小さな断片が速く移動します。フラグメントは、異なるサイズを有するように、電気泳動の最終結果は、異なるラインではなく、彗星の形状に連続ではありません。システムは、得られた「彗星」のため、細胞内のDNA切断の定量化を可能にします。

コメットアッセイの方法は、再現性のある結果を描画するが、それは様々な要因によって影響され得ます。そのような要因の1つは、白血球が溶解前、ゲル電気泳動、またはこのステップは、新たに調製した白血球の上で実行されるかどうかに凍結保存されているか否かである。 図2は 、白血球が溶解前およびゲル電気泳動SS-DNAに凍結保存したグループ2、でていることを示していますブレークは、溶解し、ゲル-electrophoresisが新たに調製された細胞で行ったグループ1に比べ、有意に高かったです。 アッセイはまた、間接的に全身酸化ストレスを評価するために使用され得ます。表1は、喫煙者と健常者でTail-モーメントとOlive-モーメントの記述統計量を示しています。データは、毎日タバコの半分パック喫煙する循環白血球9でのssDNA休憩を倍以上のことが明らかになりました。 <img alt="図1（a）" src= &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52763 / 52763fig1A.jpg&quot; /&gt; <img alt="図1B" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig1B.jpg" /> 図1（A）は、コメットアッセイの解析中に使用される顕微鏡を示しています。 （B）Δは明るいヘッドとテール（損傷した小さいDNA断片）を有する典型的な「彗星」を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52763/52763fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig2.jpg" /> 白血球は、新たに調製した白血球が溶解し、ゲル電気泳動の前に使用したときよりも（グループ2）凍結保存したときに、図2のssDNAブレークが有意に高かったです。 <imgALT = &quot;表1&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52763 / 52763table1.jpg&quot; /&gt; 表1喫煙者は一本鎖DNAの倍以上の数が健康な非喫煙者にマッチした年齢や性別に比べて壊れていました。

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Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

コメットアッセイは、様々な要因によって誘発されるDNA破壊を測定します。 DNAの損傷を引き起こす（酸化ストレスを除く）すべての要因が一定に保持される場合、DNA損傷の量は、酸化ストレスの良い間接的なパラメータです。このプロトコルの目的は、酸化ストレスの間接的な測定のためのコメットアッセイを使用することです。

全身酸化ストレスの間接的な指標として、コメットアッセイ

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

comet-assay-as-an-indirect-measure-of-systemic-oxidative-stress

Research

JoVE Journal

Biology

29.2K ビュー.  University of Basel. コメットアッセイは、様々な要因によって誘発されるDNA破壊を測定します。 DNAの損傷を引き起こす（酸化ストレスを除く）すべての要因が一定に保持される場合、DNA損傷の量は、酸化ストレスの良い間接的なパラメータです。このプロトコルの目的は、酸化ストレスの間接的な測定のためのコメットアッセイを使用することです。 

ビデオ: Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

光強度の変化にゼブラフィッシュの応答性を測定する行動アッセイ

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

生物学

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

全プラスミドの自家製のサイトが特異的突然変異誘発

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of aerobic life. Molecular oxygen is essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many damaging reactions within living organisms. The combination of aerobic metabolism and iron, which is another vital compound for life, is enough to produce radicals through Fenton chemistry and degrade cellular components. DNA degradation is arguably the most damaging process involving intracellular radicals, as DNA repair is far from trivial. The assay presented in this article offers a quantitative technique to measure and visualize the effect of molecules and enzymes on radical-mediated DNA damage.
The DNA protection assay is a simple, quick, and robust tool for the in vitro characterization of the protective properties of proteins or chemicals. It involves exposing DNA to a damaging oxidative reaction and adding varying concentrations of the compound of interest. The reduction or increase of DNA damage as a function of compound concentration is then visualized using gel electrophoresis. In this article we demonstrate the technique of the DNA protection assay by measuring the protective properties of the DNA-binding protein from starved cells (Dps). Dps is a mini-ferritin that is utilized by more than 300 bacterial species to powerfully combat environmental stressors. Here we present the Dps purification protocol and the optimized assay conditions for evaluating DNA protection by Dps.

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

The DNA-binding protein from starved cells (Dps) plays a crucial role in combating bacterial stress. This article discusses the purification of E. coli Dps and the protocol for an in vitro assay demonstrating Dps-mediated protection of DNA from degradation by reactive oxygen species.

の適用<em&gt;インビトロ</emDPSタンパク質のストレス調停プロパティを可視化するために&gt; DNA保護アッセイ

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

ゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスの分析

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

酸化ストレスに赤/近赤外光療法の波長および強度の範囲の効果の評価のための手法<em&gt;インビトロ</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

の酸化ストレス抵抗を測定<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt; 96ウェルのマイクロタイタープレート中

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

マウス乳腺の凍結切片の間接免疫

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

インビトロアッセイではホスファチジルメチルトランスフェラーゼ活性を測定します

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

ラットの肝臓におけるDNA鎖切断および酸化的DNA損傷を測定するためのインビボアルカリコメットアッセイおよび酵素修飾されたアルカリコメットアッセイで

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to stress conditions, are implicated in various aspects of cell metabolism and survival. SGs modulate cellular signaling pathways, post-transcriptional gene expression, and stress response programs. The formation of these mRNA-containing granules is directly connected to cellular translation. SG assembly is triggered by inhibited translation initiation, and SG disassembly is promoted by translation activation or by inhibited translation elongation. This relationship is further highlighted by SG composition. Core SG components are stalled translation pre-initiation complexes, mRNA, and selected RNA-binding Proteins (RBPs). The purpose of SG assembly is to conserve cellular energy by sequestering translationally stalled housekeeping mRNAs, allowing for the enhanced translation of stress-responsive proteins. In addition to the core constituents, such as stalled translation preinitiation complexes, SGs contain a plethora of other proteins and signaling molecules. Defects in SG formation can impair cellular adaptation to stress and can thus promote cell death. SGs and similar RNA-containing granules have been linked to a number of human diseases, including neurodegenerative disorders and cancer, leading to the recent interest in classifying and defining RNA granule subtypes. This protocol describes assays to characterize and quantify mammalian SGs.

Stress Granules (SGs) are nonmembranous cytoplasmic structures that form in cells exposed to a variety of stresses. SGs contain mRNAs, RNA-binding proteins, small ribosomal subunits, translation-related factors, and various cell signaling proteins. This protocol describes a workflow that uses several experimental approaches to detect, characterize, and quantify bona fide SGs.

哺乳類のストレス顆粒としての細胞質叢を分類する方法

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...