The authors would like to acknowledge the Utah Science Technology and Research fund for support of YML and the Korea National Research Foundation grants (2009-0069679 and 2010-0010154) for support of SIY. This research was supported by the Utah Agricultural Experiment Station, Utah State University, and approved as journal paper number UAES #8753. Also, the authors thank Dr. Deborah McClellan for editorial assistance.

The authors have declared that they have no competing financial interests.

現在のプロトコルが正常JEV、その機能的なcDNAを構築することが本質的に困難であることが証明されたとフラビウイルスの二つの異なる株（CNU / LP2 27、SA 14 -14-2 28）の全長の感染性cDNAクローンを生成するために使用されていますなぜなら、宿主細胞毒性およびクローニングされたcDNAの遺伝的不安定性の伝播8,74-76このプロトコルは、三つの主要なコンポーネントが含ま：。最初、高忠実度の逆転写酵素を用いてウイルスRNAの忠実なcDNAコピーの合成/増幅を最大化します/ DNAポリメラーゼ。第二に、最終的な完全長cDNAの組立工程にサブクローニング最初のcDNAからの非常に低コピー数ベクターのBACにおける毒性系列（未発表データ）74,77,78を含むウイルスPRM-Eコード領域をクローニングします。第三、明らかにより大きいDNA inseを許容120〜350キロバイトの平均サイズ、19-21で外来DNAを収容することができ、クローニングベクター、BACを利用他のクローニングベクターが行うよりも、RTS。このクローニングアプローチは、他の多くのプラス鎖RNAウイルス、〜10から32キロバイトの大RNAゲノムと特にに一般的に適用されます。そのゲノムが宿主細​​胞リボソームによるタンパク質に翻訳されるようなウイルスのmRNAを作用するための感染性cDNAクローンの発生は、特に、ポジティブ鎖RNAウイルスは、RNAウイルスの逆遺伝学系の開発における重要なステップです。従って、ウイルス複製は、感受性の宿主細胞へのcDNA由来のゲノム長RNA分子を導入することによって開始することができます。感染性JEV cDNAクローンの利用可能性は、組換えDNA技術と組み合わせると、このような遺伝子発現73,79およびゲノム複製として、分子レベルでウイルスのライフサイクルの様々な態様の理解を増加している。63,64にも、完全長のJEV cDNAクローンは、抗ウイルスワクチン28および遺伝子送達ベクターの開発のための貴重なツールであることが証明されました。&lt;SUP&gt; 80,81 すべてのプラス鎖RNAウイルスと同様に、高度に感染性RNAをin vitroで合成することが可能なJEV cDNAのための信頼できる機能を構築する際に、複数の重要なステップがあります。理想的には、全長cDNAのクローンから転写された合成RNAの配列は、ウイルスゲノムRNA、ウイルスRNA複製の開始のために必要とされ、特に5 &#39;および3&#39;末端配列と同一であるべきです。60-62現在のプロトコルでは、本物の5 &#39;末端および3&#39;末端は、最後の下流のウイルスゲノムの最初のアデニンヌクレオチドの上流にSP6プロモーター配列を配置し、ユニークな人工のXba I制限部位を配置することによって確保されましたそれぞれウイルスゲノムのチミンヌクレオチド、。 Xba I-直線化し、MBN処理されたcDNAをTEのランオフ転写によって生成された本物の5 &#39;末端および3&#39;末端を有する合成RNAを頂きましたmplateメートル7 G（5 &#39;）で下塗りし、SP6 RNAポリメラーゼのppp（5&#39;）キャップアナログを使用。このプロトコルは、いくつかの方法で変更することができます。 インビトロ転写のために、別のバクテリオファージRNAポリメラーゼ（例えば、T3またはT7）は、明確に定義されたプロモーター配列と組み合わせて使用することができる。27、それが中に存在しない場合、ランオフサイト、別の制限部位を利用することができるように直線化cDNAからのウイルスゲノムとするならば、合成RNAは、本物の3 &#39;末端で終わります。合成RNAは、その3 &#39;末端に3つまたは4つのウイルス関連のないヌクレオチドが含まれている場合、3&#39;末端のヌクレオチド配列の重要性は、RNAの感染力で約10倍の減少によって実証されている。in vitro転写反応において27、両方M 7 G（5 &#39;）pppの（5&#39;）Aおよびm 7 G（5 &#39;）pppの（5&#39;）Gキャップ類似体は、後者の場所ウイルス5の上流に無関係な余分なGヌクレオチドが、等しく良好に使用することができ&#39;末端が、そのさらには、合成RNAの感染性または複製を変更しません。27 cDNAテンプレート自体は感染性ではないのでまた、DNアーゼI消化によるRNA転写物からcDNA鋳型の除去は、RNAの感染性試験の必要はありません。27 BAC技術は現在、プラス鎖RNAウイルス、すなわち二つJEVs、CNU / LP2 27、SA 14 -14-2 28（ゲノムサイズ、〜11 KB）の一握りのための感染性cDNAクローンの構築に適用されています。 2デング熱ウイルス、BR / 90 26とNGC 29（〜11キロバイト）牛ウイルス性下痢ウイルス、SD1（〜12キロバイト）; 25 2古典的ブタ熱ウイルス、Cとパーダーボルン（〜12キロバイト）; 24ボーダー病ウイルス、ギフホルン（〜12キロバイト）; 24豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、PL97-1 / LP1（〜15キロバイト）; 30伝染性胃腸炎ウイルス、PUR46-MAD（〜29キロバイト）; 16ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、DF-2（〜29キロバイト）; 32重症急性呼吸器症候群コロナウイルス、ウルバーニ（〜30キロバイト）; 9中東呼吸器症候群コロナウイルス、EMC / 2012（〜30キロバイト）; 17およびヒトコロナ、OC43（〜 31 KB）31のcDNAの構築のためのBACを使用することの主な利点は、大規模な、1または2コピーのBACプラスミドの高い遺伝的安定性です。しかし、その非常に低コピー数の固有の性質があるため、BAC DNAと染色体DNAを、ホストとのBAC DNAの純度の結果としての削減の非常に低い収率で、また大きな欠点です。現在のプロトコルでは、BAC DNAの収量は 、E を成長させることによって最大化されます大腸菌 DH10B栄養豊富な培地の2×YTで感染性BACてpBAC / SA 14 -14-2で形質転換しました。この努力にもかかわらず、平均利回りはわずか〜15μgのの2×YTブロスの500ミリリットルからBAC DNAのです。また、BAC DNAの純度が最高の精製のためのCsCl-EtBrを密度勾配遠心分離を使用することによって達成されますむしろ、一般的に使用される列ベースのプラスミド分離より。しかし、それは心に留めておくことは重要であるBAC- 形質転換したE.それがクローニングされたcDNAの遺伝的安定性を危うくする可能性があるため、 大腸菌が過剰成長べきではない、と高い成長が必ずしも大きい利回り以上純度BAC DNAにはつながりません。 ここで説明するプロトコルは、JEVのためのBACとして遺伝的に安定、全長感染性cDNAクローンの構築および増殖のための最適化、効率的、かつ合理化法である、手順をもう一度事実上不可能と思いました。この同じクローニング戦略は、多くの他のプラス鎖RNAウイルスに適用することができます。一般的に、感染性cDNAクローンは、ウイルスの複製および病因にその生物学的機能を研究するために、ウイルスRNAゲノムに変異（例えば、欠失、挿入、および点変異）の様々なを紹介することが可能となります。このcDNAベースの逆遺伝学系を開発することを可能にし、TESTワクチンと目的の特定のプラス鎖RNAウイルスの病原性因子を標的とする治療候補。また、この感染性cDNA技術は、生物医学研究の多くの用途のために、目的の外来遺伝子を発現することができるウイルスベクターとして利用することができます。

RNAのウイルス学者は、1970年代後半における組換えDNA技術の出現は、その後、RNAウイルスの遺伝子操作のための細菌中でのプラスミドとして増殖することができたcDNAクローンの中にウイルスRNAゲノムを変換することができた。1最初のRNAウイルスであることがクローン化された分子は、バクテリオファージQβ、 大腸菌に感染するプラス鎖RNAウイルスでした。 大腸菌に導入された場合QβゲノムRNAの完全なcDNAコピーを含むプラスミドは、感染Qβファージを生じましたコリ 2その後すぐに、この技術は、ポリオウイルス、ヒトおよび動物のプラス鎖RNAウイルスに適用しました。ポリオウイルスのゲノムRNAの完全長cDNAを有するプラスミドは、感染哺乳動物細胞にトランスフェクトし、感染性ビリオンを産生することができたときに3を 、クローン化したcDNAを、ウイルスRNA複製を開始するために細胞内で転写されるべきこの「DNA発射」アプローチでは。しかし、それは、転写が開始される方法および転写産物が正しいウイルス配列にどのように処理されるかは不明です。この懸念は、代替「RNA-立ち上げ」の開発につながっているのアプローチ、ウイルスRNAゲノムの完全なcDNAコピーは 、Eによって認識されるプロモーター下にクローニングされます宿主細胞に導入された場合、完全なウイルス複製サイクルを受ける定義の5 &#39;および3&#39;末端を有する、インビトロでの合成RNAの産生のための大腸菌やファージRNAポリメラーゼ。このアプローチの最初の成功は、ブロムモザイクウイルスについて報告された4,5 、6,7植物のプラス鎖RNAウイルス。それ以来、RNA-打ち上げのアプローチは、カリシウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、アルテ、およびコロナウイルスなどのプラス鎖RNAウイルス、広範囲のために開発されました。1,4,5,8- DNA-との両方で、FULの建設を逆遺伝学システムをRNA発射、〜10の大RNAゲノムリットル長cDNAクローンは、ポジティブ鎖RNAウイルスの感染性DNAまたはRNAを生成するための鍵であるが、ウイルスゲノムのサイズが大きくなるように、かなりの技術的な課題となる。具体的には9-17 -32キロバイトは、完全長cDNAのクローニング機能には3つの大きな障害を提示している。18 RT-PCRの忠実度は、ウイルスRNAの長さに反比例するので、最初の難しさは、忠実なのcDNAコピーの合成です。長いRNA分子がE.で不安定なプラスミド中のcDNA断片を作製することが可能な、予期しない配列を含有する可能性が高いので、第二のハードルは、潜在的に毒性の配列の存在であります大腸菌 。それは&gt; 10 kbのウイルスのcDNAインサートを収容することができるクローニングベクターを見つけることは困難であるため、第三の、最も重要な問題は、適切なベクターが利用可能です。過去30年間にわたり、これらの障壁は、酵素学、方法論、ANにはいくつかの進歩によって克服されていますDのvectorology。これらのうち1,4,5,8は 、最も有望で革新的な開発は、大きなプラス鎖RNAウイルスなどの感染細菌人工染色体（BACの）のクローニングです。 BACベクターは 、Eに基づいて、低コピープラスミドクローニング（1-2コピー/細胞）であります〜120〜350キロバイトの平均DNAインサートサイズの大腸菌出生率、19-21 DNA断片は、一般的なクローニングベクターへのクローニングと同様にBACベクター中に挿入されます。結果としてBACクローンは 、Eの多くの世代にわたって安定しています大腸菌。現在までに22,23、BAC技術は、3つの正鎖RNAウイルスファミリーの&gt; 10のメンバー、 すなわち 、 フラビウイルス科 、24-29 アルテ 、30とコロナのための感染性cDNAクローンを作成するために使用されています。9,16,17 、31,32 例として、日本脳炎ウイルス（JEV）を使用して、本研究は、することができ、詳細な手順を報告プラス鎖RNAウイルスの様々な遺伝的に安定、全長感染性BACを構築するために使用されます。で発生JEVは、JEV感染が深刻なしばしば致命的な神経疾患日本脳炎を引き起こす可能性がヒトでは人獣共通感染蚊ベクトルによって鳥、豚、および他の脊椎動物のホスト間の自然の中で伝送されるフラビウイルス33。34,35です（JE）、36 〜50,000-175,000臨床例推定年間発生率とアジアと西太平洋、37,38の一部。39,40 JEVのゲノムは、〜11-kbの、一本鎖、正センスRNA分子であり、で構成されてい5における2つの非コード領域（のNCR） &#39;および3&#39;末端により隣接する単一のオープンリーディングフレーム（ORF）41,42 ORFは、指定された、10の個々のタンパク質を生成する宿主およびウイルスのプロテアーゼによって切断されるポリタンパク質をコードC、のprM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、およびNS5また、N末端 ​​からC末端への方向インチ34,43,44、電子NS1（NS1 &#39;）のXtendedでは、フォームがコドンNS2Aの8-9でのことで-1リボソームフレームシフト表現されている。これら11タンパク質のうち45,46、3つの構造タンパク質（C、のprM、およびE）は、感染の形成のために不可欠ですビリオン、47,48と残りの8非構造タンパク質（NS5にNS1、およびNS1 &#39;）はウイルスRNA複製、49-51粒子アセンブリ、52-56と自然免疫の回避のために非常に重要である。57〜59の両方の5&#39;および3 「のNCRは、保存された一次配列を含み、ウイルスRNA複製を調節するために重要であるRNA二次/三次構造、60〜62を形成する 。63,64 このプロトコルは、SA 14 -14-2全長のJEVの感染性BACを生成するためのツール、方法、および戦略について説明します。28この機能BACクローンは、プロモーターに含まれるJEVゲノムRNAの完全なcDNAコピー、65が含まれています SP6 RNAポリメラーゼのための上流ウイルス5 &#39;末端およびin vitroでのランオフ転写のためのウイルスの3&#39;末端の下流の独特のXba I制限部位の。このBAC技術は、プラス鎖RNAウイルスの配列に完全に機能するcDNA分子クローンの構築に適用可能です。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1054">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">1. Molecular Cloning</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">2xYT Broth</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">Y2377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">[3H]UTP</td>
			<td style="width:275px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:243px;">NET380250UC</td>
			<td>Radioactive</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">50-mL Tube</td>
			<td style="width:275px;">Thermo Scientific (Nalgene)</td>
			<td style="width:243px;">3114-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">250-mL Bottle</td>
			<td style="width:275px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:243px;">356011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Agarose</td>
			<td style="width:275px;">Lonza</td>
			<td style="width:243px;">50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Agarose (Low Melting Point)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">AvaI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0152S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">AvrII</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0174S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">BamHI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">BsiWI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0553S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">BsrGI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Butanol</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:243px;">A399-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Cap Analog [m7G(5&#697;)ppp(5&#697;)A]</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">S1405S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Cesium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:243px;">BP1595-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Chloroform</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">C2432</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">DE-81 Filter Paper</td>
			<td style="width:275px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:243px;">3658-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">dNTP mix</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">18427-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">E. coli DH10B&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">18297-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">EDTA</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">E7637</td>
			<td>Toxic and highly mutagenic</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">K2100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">A6283</td>
			<td>Irritating</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glucose</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">G5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glycogen&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Roche</td>
			<td style="width:243px;">10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">I9392</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Isopropanol&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0918</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">LB Broth</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">12795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Lithium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">L9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">18080-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Mung Bean Nuclease</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0250S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Needle (18G, 20G)</td>
			<td style="width:275px;">BD</td>
			<td style="width:243px;">305196, 305175</td>
			<td>Biohazardous (Sharps waste)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">NotI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Oligonucleotide</td>
			<td style="width:275px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:243px;">Custom Oligonucleotide Synthesis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">PacI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">pBeloBAC11</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">ER2420S (E4154S)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Phenol (Buffer-Saturated)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">15513-039</td>
			<td>Toxic and highly corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">15593-031</td>
			<td>Toxic and highly corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Phenol:Guanidine Isothiocyanate</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Ambion)</td>
			<td style="width:243px;">10296-010</td>
			<td>Toxic, corrosive, and irritating</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Pme I</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0560S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Potassium Acetate</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">RNase Inhibitor</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">10777-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">rNTP Set</td>
			<td style="width:275px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:243px;">27-2025-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sealable Polypropylene Tube (16 &#215; 76 mm)&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:243px;">342413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">SfiI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0123S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sma I</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0141S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Acetate</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">SP6 RNA Polymerase</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0207S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Spin Column (Plasmid Miniprep Kit)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">K2100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Syringe</td>
			<td style="width:275px;">HSW NORM-JECT</td>
			<td style="width:243px;">4200.000V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Tris</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">tRNA (yeast)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">15401-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">XbaI&#160;</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Name</td>
			<td style="width:275px;">Company</td>
			<td style="width:243px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">2. Cell Culture</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Alpha Minimal Essential Medium</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">12561-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Conical Tube (50 mL)</td>
			<td style="width:275px;">VWR</td>
			<td style="width:243px;">21008-242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Crystal Violet&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Culture Dish (150 mm)&#160;</td>
			<td style="width:275px;">TPP</td>
			<td style="width:243px;">93150&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Cuvette (2-mm Gap)</td>
			<td style="width:275px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:243px;">450125&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">F1635</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glutamine</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Minimal Essential Medium</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">61100-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Six-Well Plate</td>
			<td style="width:275px;">TPP</td>
			<td style="width:243px;">92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Vitamins</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">M6895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Name</td>
			<td style="width:275px;">Company</td>
			<td style="width:243px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">3. Equipment</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Agarose Gel Electrophoresis System</td>
			<td style="width:275px;">Mupid</td>
			<td style="width:243px;">MPDEXU-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:275px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:243px;">Heracell 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Desktop Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:243px;">ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Electroporator</td>
			<td style="width:275px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:243px;">ECM 830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld)</td>
			<td style="width:275px;">UVP</td>
			<td style="width:243px;">UVGL-58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Tabletop Centrifuge</td>
			<td style="width:275px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:243px;">368826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Applied Biosystems)</td>
			<td style="width:243px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Vortexer</td>
			<td style="width:275px;">Scientific Industries</td>
			<td style="width:243px;">G-560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Water Bath</td>
			<td style="width:275px;">Jeio Tech</td>
			<td style="width:243px;">WB-10E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial artificial chromosomes: a functional genomics tool for the study of positive-strand rna viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

すべてのプラス鎖RNAウイルスの場合は、逆遺伝学システムの信頼性と効率がシーケンスウイルスゲノムRNAのコンセンサス配列と等価であるクローン化された完全長cDNAの遺伝的安定性に依存しています。27 図1は、五員環を示し、 JEV SAのBACとして、全長感染性cDNAを構築するためのステップ戦略14 -14-2 28：ステップ1、JEV感染BHK-21細胞（ 図1A）の細胞培養上清からのウイルスRNAの精製;ステップ2、全ウイルスゲノム（ 図1B）に及ぶ4重複するcDNAアンプリコン（F4にF1）の合成;ステップ3、BACベクターに4つの連続cDNA断片のそれぞれのサブクローニング、てpBAC / F4（ 図1C）にてpBAC / F1を作成します。 すなわちステップ4、SP6 ​​RNAポリメラーゼを用いたインビトロランオフ転写のためのクローン化cDNAの変更、SP6を置きますサイレント点突然変異、9134→T（てpBAC / F3 KO）を導入し、挿入することによって、ヌクレオチド9131で、既存の内部のXba I部位を排除し、すぐにウイルス5 &#39;末端（てpBAC / F1 SP6）の上流のプロモーター配列、ウイルス3 &#39;末端（てpBAC / F4 RO）（ 図1D）のすぐ下流に新たな人工のXbaIランオフサイト。ステップ5、フルレングスのSA 14 -14-2のcDNA BAC、てpBAC / SA 14 -14-2（ 図1E）。 表1に、このクローニング手順で使用されるオリゴヌクレオチドのアセンブリ。28 機能性JEV cDNAの構築のために、最初の重要なステップは、RT-PCRのための鋳型として精製されたウイルスRNAを使用して、4つの重複するcDNAフラグメントの合成である。 図2は 4であったRT-PCR産物のための代表的な結果を提供します0.8％で電気泳動アガロースゲル。このゲルは、全長のJEV cDNAは4オーバーラップするcDNA断片に増幅されていることを明確に示しています。時折、RT-PCR反応が原因cDNA合成/増幅中のプライマーの非特異的アニーリングを、予想される生成物より大部分が小さい1つ以上の追加のウイルス特異的または非特異的な生成物を生じる可能性があります。一方、ほとんど又は全く予期されるRT-PCR産物は、ウイルスRNAの単離または不適切なRT-PCRのパフォーマンス中に偶発ためのRNaseの混入の増幅されたことになります。 次の重要なステップは、partial-または全長標準的な組換えDNA技術を使用して、比較的簡単な手順であるBACにおけるJEVのcDNAのクローニングおよび変形例である。69 図3は含むBACクローンを精製するための代表的な結果を提示します塩化セシウム-EtBrを勾配にバンディングによってJEV SA 14 -14-2の完全長cDNA。この実験では、401700×gで16時間遠心分離した後、二つの異なるバンド、 すなわち 、E。上記の大腸菌の染色体DNAおよび以下のスーパーコイルBACプラスミドDNAは、長波長紫外線の下でチューブの中央に表示されます。下のBAC DNAバンドの最小量（〜400μl）を慎重にチューブの側のシリンジで穴を突っついによって回収しました。その後、EtBrをブタノール抽出によりBAC DNAから抽出し、EtBrを無BAC DNAをエタノール沈殿により濃縮しました。 最後のステップは、許容細胞へのRNAトランスフェクション（ 図4）の後に、全長SA 14 -14-2 BAC（てpBAC / SA 14 -14-2）からインビトロで転写合成RNAの特異的感染の決意です。ステップ1、3 &#39;末端に、全長SA 14 -14-2 cDNAの線形化：このステップは、3つの連続ステップが含まウイルスゲノム（ 図4A）の末端;ステップ2、ランオフ転写（ 図4B）により線形化cDNAからの合成RNAの産生;ステップ3、合成RNA（ 図4C）でトランスフェクトしたBHK-21細胞における組換えウイルスの救出。実験的に、てpBAC / SA 14 -14-2の2つの独立したクローンをのXba I消化で線状化および Xba I消化によって生成された4塩基の5 &#39;オーバーハングを除去するために、MBNで処理しました。線形化のBACは、エタノール沈殿を行い、フェノール - クロロホルム抽出によってクリーンアップされました。 2つの精製の​​BACの線形化を、0.8％アガロースゲル（ 図5A）で実証されました。フェノール - クロロホルム抽出は、線形化のBACは、RNaseフリーであることを確認するために慎重に行う必要があります。 2線形化のBACのそれぞれがm 7 G（5 &#39;）pppの（5の存在下で、SP6 RNAポリメラーゼを使用してランオフ転写のためのcDNAテンプレートを務め&#39;）キャップアナログ。合成RNAの完全性は、基準1kbのDNAラダー（ 図5B）と一緒に、0.6％アガロースゲル上で2つの転写反応混合物のアリコートを実行することによって示された。この単純なアッセイでは、主要な顕著なRNAバンドが常にちょうど移行しました3キロバイトの下にDNAバンドを参照し、シャープであるように思われました。しかし、分解したRNAは、同じゲルに塗抹外観を持っているでしょう。 感染中心アッセイは、合成RNAの特異的感染を決定するためのゴールドスタンダードです。このアッセイは、（3×10 5細胞/ウェル）、ナイーブBHK-21細胞を含む6ウェルプレート中で10倍段階希釈したエレクトロポレーションした細胞の同等のアリコートを播種し、RNA試料とBHK-21細胞を電気穿孔し、アガロースオーバーレイすることによって行いました細胞単層の上に。 4日間のインキュベーションの後、生存細胞をホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色したの細胞（ 図6A）に送達感染性RNA分子の数に対応する感染性センター（プラーク）の数を、定量化するolution。 インビトロ転写のために用いたcDNAテンプレートは非感染性であることが証明されているため、転写反応混合物の27アリコートを直接エレクトロポレーションに使用しました。エレクトロポレーションは、RNAトランスフェクションのために好ましい方法です。あるいは、RNAは、DEAEデキストラン、およびカチオン性リポソームを用いて、他の方法によってトランスフェクトすることができます。 RNAのエレクトロポレーションは、非常に有効であるが、塩がエレクトロポレーション反応やエレクトロポレーションキュベットが再利用されているか存在している場合は、電気パルスの「アーク放電」は、まれにしか発生しません。 RNAトランスフェクト細胞におけるウイルスタンパク質の発現を、抗NS1ウサギ抗血清（ 図6B）を用いて、免疫蛍光アッセイによって試験しました。 RNAトランスフェクト細胞の上清中に蓄積されたウイルス粒子の産生でしたプラークアッセイ（ 図6C）によってalyzed。これらの実験の結果は、cDNA由来の合成RNA、組換えウイルスの高力価を生成し、許容BHK-21細胞に感染性であることを明確に示します。 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> オリゴヌクレオチド </td><td> 配列（5 &#39;から3&#39;） </td><td> 位置 b </td><td> 極性 </td></tr><tr><td> 1RT </td><td> TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT </td><td> 2578-2603 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> 1F </td><td> aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT </td><td> 1-22 </td><td>センス</td></tr><tr><td> 1R </td><td> attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT </td><td> 2532-2553 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> 2RT </td><td> TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA </td><td> 5975-6000 </td><td>蟻ISENSE </td></tr><tr><td> 2F </td><td> aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT </td><td> 1800-1821 </td><td>センス</td></tr><tr><td> 2R </td><td> attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC </td><td> 5929-5950 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> 3RT </td><td> ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT </td><td> 9426-9451 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> 3F </td><td> aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT </td><td> 5500-5521 </td><td>センス</td></tr><tr><td> 3R </td><td> attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT </td><td> 9380-9401 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> 4RT </td><td> AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA </td><td> 10952から10977 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> 4F </td><td> aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA </td><td> 9200-9221 </td><td>センス</td></tr><tr><td> 4R </td><td> attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC </td><td> 10956から10977 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> SP6F </td><td> cataccccgcgtattcccac TA </td><td></td><td>センス</td></tr><tr><td> SP6R </td><td> ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa </td><td> 1-14 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> F1F </td><td> aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG </td><td> 1-17 </td><td>センス</td></tr><tr><td> F1R </td><td> TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA </td><td> 638から662 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> X1F </td><td> CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG </td><td> 8403-8427 </td><td>センス</td></tr><tr><td> X1R </td><td> AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC </td><td> 9120-9148 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> X2F </td><td> GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT </td><td> 9120-9148 </td><td>センス</td></tr><tr><td> X2R </td><td> cacgtggacgagggcatgcc tgcag </td><td></td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> ROF </td><td> CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC </td><td> 10670から10694 </td><td>センス</td></tr><tr><td> ROR </td><td> agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC </td><td> 10954から10977 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td colspan="4"> JEV配列は大文字で示されており、BAC配列は小文字で示されています。 Bのヌクレオチド位置は、JEV SA 14 -14-2（Genbank受託番号JN604986）の完全なゲノム配列を意味します。 </td></tr></tbody></table> 表1：cDNA 合成、PCR増幅、およびBAC突然変異誘発に使用したオリゴヌクレオチド。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig1.jpg" /> 図1。0; BACとして JEV SA 14 -14-2の完全長cDNAの構築のための戦略JEV粒子からのウイルスRNAの（A）の単離。 JEV SA 14 -14-2のゲノムRNAの概略図が示されています。全ウイルスゲノムをカバー（B）は、4つの重複するcDNAフラグメントの合成（F4のF1）。 （C）BACベクターに4重複するcDNA断片のサブクローニング、てpBAC / F4にてpBAC / F1を作成します。 （D）in vitroでのランオフ転写のためのクローン化cDNAの変更。 pBAC / F1 SP6は、ウイルス 5 &#39;末端の上流にSP6プロモーター配列を含むてpBAC / F1の誘導体です。 pBAC / F3 KOはサイレント点突然変異（T→9134、アスタリスク）が含まれてpBAC / F3の誘導体です。 pBAC / F4 ROはウイルス3 &#39;末端の下流の人工のXbaIランオフサイトが含まれていてpBAC / F4の誘導体です。 （E </<html>強い&gt;）、全長SA 14 -14-2 BACのアセンブリ（てpBAC / SA 14 -14-2）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig2.jpg" /> JEV SA 14 -14-2 の完全長ゲノムRNAをまたがる4重複cDNA断片（F1〜F4は）図2.合成 。 4 RT-PCR産物は0.8％アガロースゲルでの電気泳動により評価されます。 M、1kbのDNAラダー。 4 cDNA断片の予想サイズは、ゲル画像の下部に表示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> /ftp_upload/53164/53164fig3.jpg &quot;/&gt; JEV SA 14 -14-2 の完全長cDNAを含むBAC図3. 精製 BACプラスミドを大腸菌から単離されますSDS-アルカリ溶解法によって大腸菌 DH10Bをさらに塩化セシウム、EtBrを勾配にバンディングによって精製しました。発表16×76ミリメートルシール性ポリプロピレンチューブを使用してのCsCl-EtBrを勾配の一例である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig4.jpg" /> BACで組み立て た全長のJEV SA 14 -14-2 cDNAからの 感染性ウイルスの回収の図4.概要 。cDNAテンプレートの（A）線形化。 JEV BACがで切断されたフルレングスMBNで処理をXba Iと。 （B）RNA転写物の合成。線形化されたcDNAをM 7 G（5 &#39;）pppの（5&#39;）のキャップ類似体の存在下でSP6 RNAポリメラーゼによって転写されます。 （C）の合成JEVsの回収。 in vitroで転写されたRNAは、合成ウイルスの高力価を生成し、エレクトロポレーションにより、BHK-21細胞にトランスフェクトされている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig5.jpg" /> cDNAをテンプレートとして、全長のJEV BACを用いたin vitro 転写により RNAの図5の合成 。線形化、全長のJEV BACの（A）の生成、てpBAC / SA 14 -14-2。 pBACの二つの独立したクローン/ SA 14 -14-2（Cl.1とCl.2）はMBNとXbaIで消化し ​​、その後の処理により直線化されています。線形化されたBACは、0.8％アガロースゲルでの電気泳動によって検査されます。ランオフ転写によって合成RNAの（B）の製造。 2線形化のBACのそれぞれは、SP6 RNAポリメラーゼランオフ転写のための鋳型として使用します。 2つの転写反応物のアリコートを、0.6％アガロースゲル上で実行されています。 Mは、1キロバイトのDNAラダー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig6.jpg" /> 全長のJEVのBACおよび合成ウイルスの回収から転写された合成RNAの図6.特定の感染。BHK-21細胞はモックエレクトロポレーション（モック）であるか、又はFRに由来するRNA転写産物を電気穿孔全長のJEV BAC（Cl.1とCl.2）の二つの独立したクローンのそれぞれをOM。 （A）RNAの感染力。細胞は、アガロースを重層し、トランスフェクション後4日目にクリスタルバイオレットで染色します。 RNAの感染性細胞（左パネル）にエレクトロポレーション、感染性RNAの量を推定するために、感染中心アッセイにより決定されます。また、感染性センターの代表画像（​​右パネル）が示されています。 （B）タンパク質発現。細胞を4ウェルチャンバースライド中で培養します。 20時間後、トランスフェクション（HPT）において、RNAエレクトロポレーションした細胞におけるウイルスタンパク質の発現は一次抗NS1ウサギ抗血清および二次Cy3結合ヤギ抗ウサギIgG（赤色）を用​​いて免疫蛍光アッセイにより分析されます。核を4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（青）で対比されています。免疫蛍光画像は、対応する微分干渉コントラスト画像にオーバーレイされます。 （C）ウイルス収量。細胞は1で培養します50 mmの培養皿。 22と40 HPTで、RNAエレクトロポレーションした細胞の培養上清中に蓄積された感染性ビリオンの生産をプラークアッセイにより検討されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

細菌人工染色体：プラス鎖RNAウイルスの研究のための機能ゲノミクスツール

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.2K ビュー.  Utah State University. Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.