The authors would like to acknowledge the Utah Science Technology and Research fund for support of YML and the Korea National Research Foundation grants (2009-0069679 and 2010-0010154) for support of SIY. This research was supported by the Utah Agricultural Experiment Station, Utah State University, and approved as journal paper number UAES #8753. Also, the authors thank Dr. Deborah McClellan for editorial assistance.

The authors have declared that they have no competing financial interests.

Mevcut protokolü başarılı bir şekilde, iki farklı suşları (CNU / LP2 27 ve SA 14 -14-2 28) JEV,, fonksiyonel cDNA kanıtlamıştır oluşturmak için doğal zor bir flavivirüs ve tam uzunlukta enfeksiyon cDNA klonlarının üretilmesi için kullanılmıştır Çünkü konakçı hücre toksisitesi ve klonlanmış cDNA&#39;dan genetik instabilitesi yaymak 8,74-76 Bu protokol, üç ana bileşeni içerir:. yüksek kalitede ters transkriptaz kullanılarak viral RNA&#39;nın bir cDNA sadık bir kopyasının sentezi / amplifikasyon maksimize, birinci / bir DNA polimerazı; ikinci olarak, son, tam uzunlukta cDNA takımı adımları alt klonlama başlangıç ​​cDNA&#39;dan çok düşük kopya sayılı vektör BAC (yayınlanmamış veriler), toksik sekanslar ihtiva eden viral prM-E kodlama bölgesini 74,77,78 klonlanması; ve üçüncü, görünüşe göre daha büyük bir DNA INSE tolere 120-350 kb, 19-21 arasında bir ortalama boyutu olan bir yabancı DNA için uygun bir klonlama vektörü kullanılarak BACdaha rts başka klonlama vektörleri yapmak. Bu klonlama yaklaşımı birçok pozitif sarmallı RNA virüsleri, ~ 10 ila 32 kb&#39;lik bir büyük RNA genomu olan, özellikle de genel olarak geçerli olacaktır. Genom konukçu hücre ribozomlar tarafından proteinler çevrilir viral mRNA görür, çünkü enfeksiyon cDNA klonunun Generation, özellikle de pozitif sarmallı RNA virüsleri için, RNA virüs bir karşıt genetik sistem geliştirilmesi önemli bir adımdır. Bu durumda, viral replikasyon duyarlı bir konakçı hücreye bir cDNA kaynaklı genom uzunlukta RNA molekülünün yerleştirilmesi suretiyle başlatılabilir. Bulaşıcı JEV cDNA klonunun durumu, yeniden birleştirici DNA teknolojisi ile birlikte kullanıldığında, bu tip gen ekspresyonu 73,79 ve genom replikasyonu gibi, moleküler seviyede viral yaşam döngüsünün çeşitli yönlerine ilişkin anlaşılmasını artmıştır. 63,64 Ayrıca, tam uzunluktaki cDNA klonu JEV antiviral aşı 28 ve gen iletim vektörleri gelişimi için değerli bir alet olduğu kanıtlanmıştır. &lt;sup&gt; 80,81 Tüm pozitif sarmallı RNA virüsleri gibi, yüksek derecede bulaşıcı RNA&#39;lar, in vitro olarak sentezlenebilir olan JEV için güvenilir bir fonksiyon cDNA&#39;yı oluşturmak birden çok kritik adım vardır. İdeal olarak, tam uzunluktaki cDNA klonu transkribe sentetik RNA&#39;ların dizisi viral genomik RNA, viral RNA replikasyonunun başlatılması için gerekli olan, özellikle 5&#39;- ve 3&#39;-terminal dizilerinin aynı olmalıdır . 60-62 mevcut protokol otantik 5 &#39;ve 3-uçları geçen alt baş viral genomunun birinci adenin nükleotid üst akışında SP6 promotör sekansını yerleştirilmesi ve yapay benzersiz Xba I sınırlama sitesi konumlandırılması sağlanmıştır sırasıyla, viral genomun timin nükleotid. Bir Xba I ile doğrusallaştırılmış ve MBN ile tedavi edilen cDNA te run-off transkripsiyonu ile üretildi otantik 5 &#39;ve 3&#39; uçları olan sentetik RNA&#39;ların Kapaklımplate m 7 G (5 &#39;) ile prime SP6 RNA polimerazı ppp (5&#39;), bir başlık kullanarak analog. Bu protokol, çeşitli şekillerde değiştirilebilir. Bu içinde mevcut değilse, in vitro transkripsiyon için, bir bakteriyofaj RNA polimeraz (örneğin, T3 ya da T7) iyi tanımlanmış promotör sekansı ile bağlantılı olarak kullanılabilir. 27, bir çalışma-dışı sitesi olarak, farklı bir kısıtlama alanı kullanılabilir doğrusallaştırılmış cDNA&#39;dan viral genom ve eğer sentetik RNA otantik 3 &#39;ucu ile biter. Sentetik RNA, 3 &#39;ucunda üç veya dört virüs ilişkisiz nükleotidini ihtiva ettiği zaman, 3&#39;-ucu nükleotid dizisinin önemi RNA enfekte bir ~ 10 kat azalma ile gösterilmiştir. Bir in vitro transkripsiyon reaksiyonunda 27, her iki m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;), A ve m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) G kap analog 5 viral ikinci yerleri ne kadar alakasız bir ekstra G nükleotid yukarı aynı kalitede kullanılabilir &#39;-end, ancakİlave enfeksiyon veya sentetik RNA replikasyonunu değiştirmez. 27 Ayrıca, DNase I sindirimi ile RNA transkriptlerinden cDNA şablonu çıkarılması RNA enfekte testler için gerekli değildir, cDNA şablonu kendisi bulaşıcı değildir, çünkü. 27 BAC teknolojisi artık pozitif sarmallı RNA virüslerinin, yani, iki JEVs, CNU / LP2 27 ve SA 14 -14-2 28 (genom boyutu, ~ 11 kb) bir avuç enfeksiyon cDNA klonlarının oluşturulması uygulanmıştır; İki dang virüs, BR / 90 26 ve NGC 29 (~ 11 kb); sığır viral diyare virüsü, SD1 (~ 12 kb) 25 iki domuz vebası virüsleri, C ve Paderborn (~ 12 kb) 24 sınır hastalığı virüsü, Gifhorn (~ 12 kb) 24 domuz üreme ve solunum sendromu virüsü , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb) 30 bulaşıcı gastroenterit virüsü, PUR46-MAD (~ 29 kb) 16 kedi bulaşıcı peritonit virüsü,DF-2 (~ 29 kb) 32 ağır akut solunum sendromu coronavirus, Urbani (~ 30 kb) 9 MERS-CoV, EMC / 2012 (~ 30 kb) 17 ve insan koronavirüsü, OC43 (~ 31 kb) 31 cDNA yapımı için BAC&#39;ler kullanılarak ana avantajı, büyük, 1- ya da 2-kopyalama BAC plazmidlerin yüksek genetik stabilitesidir.; Bununla birlikte, son derece düşük kopya sayısı iç yapısı nedeniyle BAC DNA ve kromozomal DNA&#39;yı barındıran göre BAC DNA saflıkta azalmasının çok düşük verimleri, aynı zamanda büyük bir dezavantaj teşkil etmektedir. Geçerli protokolde, BAC DNA verimi E. büyüyen maksimize edilir coli DH10B bir besin açısından zengin bir ortamda, 2xYT içinde / bulaşıcı BAC pBAC ile SA 14 -14-2 dönüştürdü. Bu çabaya rağmen, ortalama verim sadece ~ 15 ug 2xYT suyu 500 ml BAC DNA taşımaktadır. Ayrıca, BAC DNA saflığı en iyi temizleme için CsCl-EtBr yoğunluk gradyan santrifüj ile elde edilirOldukça yaygın olarak kullanılan kolon bazlı plazmid izolasyon daha. Ancak, akılda tutulması gereken önemli olduğunu BAC-dönüştürülmüş E. klonlanmış cDNA genetik istikrarı tehlikeye olabilir çünkü coli sarmak olmamalı ve yüksek büyüme mutlaka büyük verimleri veya daha yüksek saflıkta BAC DNA yol açmaz. Burada açıklanan protokol JEV bir BAC olarak genetik olarak stabil, tam uzunlukta enfeksiyon cDNA klonunun inşaat ve yayılması için optimize edilmiş, etkili ve akıcı bir yöntemdir, bir prosedür bir kez pratik olarak imkansız düşünülmektedir. Bu, aynı klonlama stratejisi aynı zamanda pek çok diğer pozitif sarmallı RNA virüsü tatbik edilebilir. Genel olarak, bulaşıcı cDNA klonları, viral replikasyon ve patogenezinde biyolojik fonksiyonlarını incelemek için, bir viral RNA genomu içine mutasyon (örneğin, silmeler, girmeler ve nokta mutasyonları) çeşitli tanıtmak için olanak sağlar. Bu cDNA tabanlı ters genetik sistemi geliştirmek mümkün ve tes kılart aşısı ve belirli bir ilgi pozitif sarmallı RNA virüsü oluşturma faktörünü (ler) hedefleyen terapötik aday. Buna ek olarak, bu bulaşıcı cDNA&#39;dan teknolojisi de biyomedikal araştırmalarda birçok uygulama için, ilgili bir yabancı gen (ler) ifade edebilen bir virüs vektörü olarak kullanılabilir.

RNA virologists, 1970&#39;lerin rekombinant DNA teknolojisindeki gelişmeler, daha sonra mümkün RNA virüslerinin genetik manipülasyonu için bakterilerde plazmidler gibi yayınlanabilirdi cDNA klonları, viral RNA genomları dönüştürmek için yapılmıştır. 1, ilk RNA virüsü olduğu Klonlanmış moleküler bakteriyofaj Qβ, Escherichia coli bozar pozitif sarmallı RNA virüsü oldu. E. verildiğinde Qβ genomik RNA&#39;nın bir cDNA kopyasını ihtiva eden bir plasmid, bulaşıcı Qβ fajlar yol açan E. coli. 2 Kısa bir süre sonra, bu teknik, poliovirüs uygulanan, insanlarda ve hayvanlarda bir pozitif tek iplikli RNA virüsüdür edildi. Çocuk felci virüsü genomik RNA&#39;nın bir tam boy bir cDNA taşıyan bir plazmid, bulaşıcı memeli hücrelerine transfekte edilmiş ve enfeksiyöz virionlann üretebilen zaman 3, klonlanmış cDNA&#39;lar, viral RNA replikasyonunu başlatmak için hücre transkribe edilmesi gerekmektedir, bu &quot;DNA başlatıldı&quot; yaklaşımında.;transkripsiyon başlatılır ve nasıl transkript doğru viral diziye nasıl işlendiğini, ancak belirsizdir. Bu kaygı, bir alternatif &quot;RNA fırlatılan&quot; bir gelişmesine yol açmıştır yaklaşımı viral RNA genomunun tam bir cDNA kopyası bir E. tarafından tanınan bir promoter altında klonlanır, böylece Ev sahibi hücre içine sokulduğunda virüsün replikasyon çembere devam tanımlandığı 5 &#39;ve 3&#39; uçlarının ile in vitro olarak sentetik RNA&#39;ların üretimi için E. coli ya da faj RNA polimeraz. Bu yaklaşım ilk başarılı brom mozaik virüsü için bildirilmiştir 4,5 6,7 bitki pozitif iplikli bir RNA virüsüdür. O zamandan beri, RNA fırlatılan bir yaklaşım kalisivirüs alfavirüsler, flavivirüsler, arteriviruses ve koronavirüslerin dahil pozitif iplik RNA virüslerinin geniş bir yelpazesi için geliştirilmiştir. 1,4,5,8 Nitelikteki DNA- ve her ikisinde de, ful inşaatı karşıt genetik sistemler RNA başlatılan~ 10 l-uzunluklu cDNA klonu enfeksiyon DNA veya pozitif sarmallı RNA virüslerinin RNA üreten anahtarı, ancak viral genomun boyutu arttıkça önemli bir teknik sorun. Özellikle 9-17, geniş bir RNA genomu olur -32 kb, tam uzunlukta cDNA işlevsel klonlama ile üç büyük sorun sunulur. RT-PCR aslına viral RNA&#39;nın uzunluğu ile ters orantılı olduğundan, 18 ilk zorluk, kopyalama sadık bir cDNA sentezi. Uzun RNA molekülleri E. kararsız plazmidler cDNA fragmanının yapabilen beklenmeyen dizileri içeren daha büyük olasılıkla, çünkü ikinci bir engel, potansiyel olarak toksik sekansların varlığı E. coli. O&gt; 10 kb viral cDNA insert ev bir klonlama vektörü bulmak zor olduğundan üçüncü ve en kritik konu, uygun bir vektör mevcudiyetidir. Son üç yılda, bu engeller enzimolojisi, metodoloji, An çeşitli gelişmeler aşılmıştırd vectorology. Bunlardan 1,4,5,8, en yenilikçi gelişimi büyük pozitif sarmallı RNA virüsleri gibi bulaşıcı bakteriyel yapay kromozomları (BAC&#39;ler) klonlanması olup. BAC vektörü E. göre bir düşük kopya plazmid klonlama (1-2 kopya / hücre) bir arasında bir ortalama DNA insert boyutu ile coli doğurganlık faktörü, ~ 120-350 kb 19-21 bir DNA parçası, genel klonlama vektörleri içine klonlama için benzer bir şekilde BAC vektörü içine sokulur.; Ortaya çıkan BAC klonları E. birçok nesiller boyunca stabil E. coli. Bugüne kadar 22,23, BAC teknolojisi yani üç pozitif iplikli RNA virüsüdür aileleri, Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 ve Coronaviridae&gt; 10 üyeleri için bulaşıcı cDNA klonları oluşturmak için kullanılır olmuştur. 9,16,17 , 31,32 Örnek olarak Japon ensefaliti virüsü (JEV) kullanarak, mevcut iş olabilir detaylı prosedürler raporlarıpozitif sarmallı RNA virüslerinin çeşitliliği için bir genetik olarak stabil, tam uzunlukta enfeksiyon BAC oluşturmak için kullanılır. Meydana JEV, JEV enfeksiyonu ağır sıklıkla ölümcül bir nörolojik hastalıktır Japon ensefalit neden olabilir İnsanlarda bir zoonotik sivrisinek vektörleri tarafından kuş, domuz ve diğer omurgalı konaklar arasında doğada iletilir flavivirüs 33. 34,35 olan (JE), 36 ~ 50,000-175,000 klinik vakaların tahmini yıllık insidansı Asya ve Batı Pasifik, 37,38 parçaları. 39,40 Jev genomu bir ~ 11-kb, tek iplikli, pozitif-sens RNA molekülüdür ve oluşan 5 &#39;ve 3&#39; iki kodlayıcı olmayan bölgeleri (NCRs) ile çevrili bir tek bir açık okuma çerçevesi (ORF) sona erer. 41,42 ORF olarak 10 bağımsız proteinlerin üretilmesi için host ve viral proteazlar tarafından bölünen bir poliproteini şifreler C prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B ve NS5 Ayrıca C-terminal yönüne N-. 34,43,44, eNS1 (NS1 &#39;) ne sahip Xtended şekilde kodonları NS2A 8-9 de tarafından -1 ribozomal çerçeve ifade edilir. Bu 11 proteinlerden 45,46, üç yapısal proteinleri (Cı prM ve E) enfeksiyon oluşumu için gerekli olan virionlar, 47,48 ve kalan sekiz yapısal olmayan proteinler (NS5&#39;in için NS1 ve NS1 &#39;), viral RNA replikasyonu, 49-51 parçacık montaj, 52-56 ve doğal bağışıklık kaçırma için çok önemlidir. 57-59 İkisi 5&#39; ve 3 &#39;NCRs birincil dizileri ve viral RNA replikasyonu modüle için önemli olan formu RNA ikincil / üçüncül yapıları, 60-62 korunmuş içerirler. 63,64 Bu protokol, SA 14 -14-2 tam uzunlukta JEV enfeksiyöz BAC üretilmesi için araçlar, yöntem ve stratejiler açıklanmaktadır. 28 Bu fonksiyonel BAC klonu bir promoter tarafından kapsanmaktadır JEV genomik RNA&#39;nın bir cDNA kopyasını, 65 içerir SP6 RNA polimeraz için üst başViral 5&#39;-uç ve in vitro Çoğaltma transkripsiyonu ayrıca viral 3&#39;-ucunun alt baş benzersiz bir Xba I kısıtlama sahasının. Bu BAC teknolojisi pozitif sarmallı RNA virüslerinin bir dizi için tamamen işlevsel bir cDNA klonu molekül oluşturmak için de geçerlidir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1054">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">1. Molecular Cloning</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td style="width:235px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">2xYT Broth</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">Y2377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">[3H]UTP</td>
			<td style="width:275px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:243px;">NET380250UC</td>
			<td>Radioactive</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">50-mL Tube</td>
			<td style="width:275px;">Thermo Scientific (Nalgene)</td>
			<td style="width:243px;">3114-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">250-mL Bottle</td>
			<td style="width:275px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:243px;">356011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Agarose</td>
			<td style="width:275px;">Lonza</td>
			<td style="width:243px;">50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Agarose (Low Melting Point)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">16520-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">AvaI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0152S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">AvrII</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0174S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">BamHI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">BsiWI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0553S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">BsrGI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0575S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Butanol</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:243px;">A399-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Cap Analog [m7G(5&#697;)ppp(5&#697;)A]</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">S1405S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Cesium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:243px;">BP1595-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Chloroform</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">C2432</td>
			<td>Carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">DE-81 Filter Paper</td>
			<td style="width:275px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:243px;">3658-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">dNTP mix</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">18427-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">E. coli DH10B&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">18297-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">EDTA</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Ethanol&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">E7637</td>
			<td>Toxic and highly mutagenic</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">K2100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glacial Acetic Acid</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">A6283</td>
			<td>Irritating</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glucose</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">G5400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glycogen&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Roche</td>
			<td style="width:243px;">10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0491S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">I9392</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Isopropanol&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0918</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">LB Broth</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">12795-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Lithium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">L9650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">M-MLV Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">18080-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Mung Bean Nuclease</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0250S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Needle (18G, 20G)</td>
			<td style="width:275px;">BD</td>
			<td style="width:243px;">305196, 305175</td>
			<td>Biohazardous (Sharps waste)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">NotI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Oligonucleotide</td>
			<td style="width:275px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:243px;">Custom Oligonucleotide Synthesis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">PacI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0547S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">pBeloBAC11</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">ER2420S (E4154S)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Phenol (Buffer-Saturated)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">15513-039</td>
			<td>Toxic and highly corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">15593-031</td>
			<td>Toxic and highly corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Phenol:Guanidine Isothiocyanate</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Ambion)</td>
			<td style="width:243px;">10296-010</td>
			<td>Toxic, corrosive, and irritating</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Pme I</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0560S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Potassium Acetate</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">RNase Inhibitor</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">10777-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">rNTP Set</td>
			<td style="width:275px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:243px;">27-2025-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sealable Polypropylene Tube (16 &#215; 76 mm)&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:243px;">342413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">SfiI</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0123S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sma I</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0141S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Acetate</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">SP6 RNA Polymerase</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0207S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Spin Column (Plasmid Miniprep Kit)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">K2100-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Syringe</td>
			<td style="width:275px;">HSW NORM-JECT</td>
			<td style="width:243px;">4200.000V0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">M0202S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Tris</td>
			<td style="width:275px;">Amresco</td>
			<td style="width:243px;">0826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">tRNA (yeast)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Invitrogen)</td>
			<td style="width:243px;">15401-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">XbaI&#160;</td>
			<td style="width:275px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:243px;">R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Name</td>
			<td style="width:275px;">Company</td>
			<td style="width:243px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">2. Cell Culture</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Alpha Minimal Essential Medium</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">12561-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Conical Tube (50 mL)</td>
			<td style="width:275px;">VWR</td>
			<td style="width:243px;">21008-242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Crystal Violet&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Culture Dish (150 mm)&#160;</td>
			<td style="width:275px;">TPP</td>
			<td style="width:243px;">93150&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Cuvette (2-mm Gap)</td>
			<td style="width:275px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:243px;">450125&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">F1635</td>
			<td>Toxic and carcinogenic</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Glutamine</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Minimal Essential Medium</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">61100-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Six-Well Plate</td>
			<td style="width:275px;">TPP</td>
			<td style="width:243px;">92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">S3264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Gibco)</td>
			<td style="width:243px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Vitamins</td>
			<td style="width:275px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:243px;">M6895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Name</td>
			<td style="width:275px;">Company</td>
			<td style="width:243px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">3. Equipment</td>
			<td style="width:275px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Agarose Gel Electrophoresis System</td>
			<td style="width:275px;">Mupid</td>
			<td style="width:243px;">MPDEXU-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:275px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:243px;">Heracell 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Desktop Centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:275px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:243px;">ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Electroporator</td>
			<td style="width:275px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:243px;">ECM 830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld)</td>
			<td style="width:275px;">UVP</td>
			<td style="width:243px;">UVGL-58</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Tabletop Centrifuge</td>
			<td style="width:275px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:243px;">368826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:275px;">Life Technologies (Applied Biosystems)</td>
			<td style="width:243px;">GeneAmp PCR System 9700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Vortexer</td>
			<td style="width:275px;">Scientific Industries</td>
			<td style="width:243px;">G-560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:304px;">Water Bath</td>
			<td style="width:275px;">Jeio Tech</td>
			<td style="width:243px;">WB-10E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial artificial chromosomes: a functional genomics tool for the study of positive-strand rna viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Tüm pozitif sarmallı RNA virüsü için bir karşıt genetik sistem güvenilirliği ve etkinliği olan dizisi viral genomik RNA&#39;nın konsensüs sekansına denk bir klonlanmış tam boy cDNA&#39;dan genetik stabilitesi, bağlıdır. 27 Şekil 1, bir beş göstermektedir JEV SA BAC gibi tam uzunlukta enfeksiyon cDNA yapımı için aşamalı bir strateji 14 -14-2 28: Aşama 1, JEV enfekte BHK-21 hücreleri (Şekil 1A), hücre kültürü üstte yüzen kısmından viral RNA&#39;nın saflaştırılması; Aşama 2, tüm viral genomun (Şekil 1B) kapsayan birbiriyle çakışan dört cDNA amplikonlarının (F1 ila F4) sentezi; PBAC / F4 (Şekil 1C) için pBAC / F1 oluşturma Aşama 3, bir BAC vektörüne bitişik dört cDNA parçalarının her birinin alt-klonlama; Aşama 4, SP6 RNA polimeraz, yani in vitro Çoğaltma transkripsiyonu için klonlanmış cDNA modifikasyonu, bir SP6 yerleştirerekpromoter dizisi, bir sessiz bir nokta mutasyonu sokulmasıyla nükleotid 9131 de önceden var olan bir iç Xba I bölgesi elimine viral 5&#39;-ucunda (pBAC / F1 SP6) hemen üst tarafından, bir 9134 T (pBAC / F3 KO) ve ekleme → Viral 3&#39;-ucunda (pBAC / F4 RO) (Şekil 1D) hemen aşağı tarafında, yeni bir yapay Xba I run-off yer; ve Aşama 5, tam uzunlukta bir montaj SA 14 -14-2 cDNA BAC, pBAC / SA 14 -14-2 (Şekil 1E). Tablo Klonlama işleminde kullanılan oligonükleotidler 1 listeler. 28 Fonksiyonel JEV cDNA yapımı için, ilk önemli adım RT-PCR için bir şablon olarak saflaştınlmış viral RNA kullanılarak, dört örtüşen cDNA fragmanlarının sentezidir. 2 olan dört RT-PCR ürünleri için temsili bir sonuç sağlar Şekil % 0.8 üzerinde elektroforezagaroz jel. Bu jel, bir tam uzunlukta cDNA JEV dört örtüşen cDNA fragmanları amplifiye olduğunu açık bir şekilde göstermektedir. Bazen, Rt-PCR reaksiyonu için cDNA sentezi / amplifikasyon prosesi esnasında primerlerin spesifik olmayan tavlamanın, istenen ürün daha çok küçük olan bir ya da daha fazla ilave virüse spesifik veya spesifik olmayan ürünler elde olabilir. Diğer taraftan, çok az veya hiç RT-PCR ürünü, viral RNA izolasyonu veya uygun olmayan RT-PCR performans sırasında kazara RNaz kirlenme amplifiye beklediği. Bir sonraki anahtar aşaması, bir kısmi ya da tam uzunluktaki standart rekombinant DNA teknikleri kullanır nispeten basit bir işlemdir BAC JEV cDNA klonlanması ve bir modifikasyonudur. 69 Şekil 3 içeren BAC klon saflaştırılması için temsili bir sonuç sunulur CsCI-EtBr gradyanı bantlayarak JEV SA 14 -14-2 tam boyda bir cDNA.Bu deneyde, 401.700 x g&#39;de 16 saat santrifüj işleminden sonra, iki farklı bantları, yani, E. Yukarıda coli kromozom DNA&#39;sı ve aşağıdaki süper-BAC plasmid DNA&#39;sı uzun dalgalı ultraviyole ışığı altında borunun ortasında görebilir. Alt BAC DNA bandının minimum bir hacmi (~ 400 | il) dikkatli bir şekilde borunun yan tarafında bulunan bir şırınga ile bir delik alay ile toplandı. Daha sonra, EtBr bütanol ekstre BAC DNA elde edildi ve EtBr içermeyen BAC DNA, etanol çökeltme ile konsantre edilmiştir. Son adım, permisif hücreler içine RNA transfeksiyonundan (Şekil 4) sonra, tam uzunluktaki SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2) in vitro olarak transkripsiyonu sentetik RNA&#39;ların spesifik enfeksiyon belirlenmesidir. 3 &#39;de Adım 1, tam uzunluktaki doğrusallaştırma SA 14 -14-2 cDNA: Bu adım, üç ardışık adımları içerir-end viral genom (Şekil 4A); Aşama 2, run-off transkripsiyon (Şekil 4B) ile doğrusallaştırılmış cDNA&#39;dan sentetik RNA&#39;ların üretimi; ve Aşama 3, sentetik RNA&#39;ların (Şekil 4C) ile transfekte edilen BHK-21 hücrelerinde rekombinant virüslerin kurtarma. Deneysel olarak, pBAC / SA 14 -14-2 iki adet bağımsız klon Xba I sindirimi ile doğrusallaştırılmış ve Xba I sindirimi ile oluşturulan dört bazlı 5 &#39;çıkıntı kaldırmak için MBN ile muamele edilmiştir. Doğrusallaştırılmış BAC etanolle çökeltme izlenmiş ve fenol-kloroform ekstraksiyonu ile temizlendi. Saflaştırılmış olan iki BAC&#39;lerin doğrusallaştırma bir% 0.8 agaroz jeli (Şekil 5A) ile gösterilmiştir. Fenol-kloroform ekstraksiyon linearize BAC&#39;ler RNaz ücretsiz olmasını sağlamak için çok dikkatli yapılmalıdır. İki linearize BAC&#39;lerin her bir m, 7 G (5 &#39;) ppp mevcudiyetinde SP6 RNA polimerazı kullanılarak Çoğaltma transkripsiyonu için bir cDNA şablon olarak kullanıldı (5&#39;) Bir kapak benzeri. Sentetik RNA&#39;ların bütünlüğü referans 1kb DNA çaprazı (Şekil 5B) ile birlikte,% 0.6 agaroz jeli üzerinde, iki transkripsiyon reaksiyonu karışımları alikotları çalıştırarak gördü. Bu basit bir deneyde, büyük bir belirgin RNA bandı her zaman sadece geçirilmiş 3 kb altında DNA bandı başvuru ve keskin olduğu ortaya çıktı. Ancak, RNA aynı jel üzerinde bir bulaşmış bir görünüm olurdu bozulmuş. Bulaşıcı bir merkez tahlil sentetik RNA&#39;ların spesifik enfeksiyon belirlenmesi için altın standarttır. Bu deney, (3 x 10 5 hücre / çukur) saf BHK-21 hücreleri ihtiva eden 6 oyuklu plakalar içinde 10-kat seri olarak seyreltilmiş elektroporate edilmiş hücrelerde eşit hacimde tohumlama, RNA örnekleri ile BHK-21 hücrelerini elektroporat ve agaroz çakıştırılarak yapıldı Hücre mono tabakaları üzerine. 4 gün süreyle inkübe edildikten sonra, kalan hücreler formaldehid ile sabitlendi ve kristal mor ile boyandı sların çözüme hücreleri (Şekil 6A) içine verilecek, enfeksiyöz RNA moleküllerinin sayısına karşılık gelir enfeksiyonlu merkezlerden (plaklar) sayısını ölçmek için. In vitro transkripsiyonu için kullanılan cDNA şablonu olmayan bulaşıcı olması için, kanıtlanmıştır yana transkripsiyon reaksiyon karışımı 27, bir kısım, doğrudan elektroporasyon için kullanılmıştır. Elektroporasyon RNA transfeksiyonundan için tercih edilen yöntemdir; Alternatif olarak, RNA DEAE-dekstran ve katyonik lipozomlar kullanılarak diğer yöntemler ile transfekte edilebilir. RNA elektroporasyon çok etkili olmakla birlikte, elektrik akımının &quot;ark&quot; Tuzlar elektroporasyon reaksiyonunda ya da elektroporasyon küveti yeniden, mevcut nadir oluşur. RNA-transfekte edilmiş hücrelerde viral proteinlerin ekspresyonu bir anti-NS1 tavşan antiserumu (Şekil 6B) kullanılarak imüno-deney ile araştırılmıştır. RNA-transfekte edilmiş hücrelerin yüzer maddeleri içinde biriken viral parçacıkların üretimi olan birplak deneyleri (Şekil 6C) tarafından alyzed. Bu deneylerin sonuçları, bir cDNA türevli sentetik RNA&#39;ların rekombinan virüslerin yüksek titresi üreten permisif BHK-21 hücrelerinde enfeksiyon olduğunu açık bir şekilde göstermektedir. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Oligonükleotid </td><td> Sekans, bir (5 &#39;ila 3&#39;), </td><td> Pozisyon b </td><td> Polarite </td></tr><tr><td> 1RT </td><td> TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT </td><td> 2578-2603 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> 1F </td><td> aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT </td><td> 1-22 </td><td> Duyu </td></tr><tr><td> 1R </td><td> attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT </td><td> 2532-2553 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> 2RT </td><td> TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA </td><td> 5975-6000 </td><td> KarıncaISENSE </td></tr><tr><td> 2F </td><td> aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT </td><td> 1800-1821 </td><td> Duyu </td></tr><tr><td> 2R </td><td> attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC </td><td> 5929-5950 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> 3RT </td><td> ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT </td><td> 9426-9451 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> 3F </td><td> aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT </td><td> 5500-5521 </td><td> Duyu </td></tr><tr><td> 3R </td><td> attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT </td><td> 9380-9401 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> 4RT </td><td> AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA </td><td> 10.952-10.977 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> 4F </td><td> aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA </td><td> 9200-9221 </td><td> Duyu </td></tr><tr><td> 4R </td><td> attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC </td><td> 10.956-10.977 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> SP6F </td><td> cataccccgcgtattcccac ta </td><td></td><td> Duyu </td></tr><tr><td> SP6R </td><td> ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa </td><td> 1-14 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> F1F </td><td> aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG </td><td> 1-17 </td><td> Duyu </td></tr><tr><td> F1R </td><td> TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA </td><td> 638-662 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> X1F </td><td> CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG </td><td> 8403-8427 </td><td> Duyu </td></tr><tr><td> X1R </td><td> AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC </td><td> 9120-9148 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td> X2F </td><td> GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT </td><td> 9120-9148 </td><td> Duyu </td></tr><tr><td> X2R </td><td> cacgtggacgagggcatgcc tgcag </td><td></td><td> Antisens </td></tr><tr><td> ROF </td><td> CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC </td><td> 10.670-10.694 </td><td> Duyu </td></tr><tr><td> ROR </td><td> agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC </td><td> 10.954-10.977 </td><td> Antisens </td></tr><tr><td colspan="4"> Bir JEV dizileri büyük harflerle gösterilir ve BAC dizileri küçük harflerle belirtilir. b nükleotid pozisyonu JEV SA 14 -14-2 (Genbank erişim numarası JN604986) tam genom sekansı anlamına gelir. </td></tr></tbody></table> Tablo 1: cDNA sentezi, PCR büyütmesi ve BAC mutagenezi için kullanılan oligonükleotidler. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig1.jpg" /> Figür 1.0, Strateji BAC olarak JEV SA 14 -14-2 bir tam boy cDNA&#39;dan yapımı için JEV partiküllerden viral RNA&#39;nın (A) izolasyonu.. JEV SA 14 -14-2 genomik RNA bir şematik diyagramı gösterilmiştir. Tüm viral genomu kapsayan (B) dört örtüşen cDNA parçalarının Sentezi (F4 F1). PBAC / F4 pBAC / F1 yaratan bir BAC vektörü içine dört örtüşen cDNA fragmanlarının (C) Altklonlaması. In vitro olarak run-off transkripsiyonu için klonlanmış cDNA&#39;lar (D) modifikasyonu. pBAC / F1 SP6 viral 5&#39;-ucunda akış yukarı SP6 başlatıcısı dizisini ihtiva pBAC / F1 bir türevidir. pBAC / F3 KO sessiz nokta mutasyonu (T → A 9134, yıldız) içeren pBAC / F3 bir türevidir. pBAC / F4 RO viral 3&#39;-ucunun alt baş yapay Xba I run-off siteyi içeren pBAC / F4 bir türevidir. (E </<html> strong&gt;) tam uzunlukta SA 14 -14-2 BAC Meclisi (pBAC / SA 14 -14-2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53164/53164fig2.jpg" /> JEV SA 14 -14-2 tam uzunlukta genomik RNA kapsayan Şekil dört örtüşen cDNA fragmanlarının 2. N- (F1 ila F4). Dört RT-PCR ürünleri,% 0.8 agaroz jeli içinde elektroforez ile değerlendirilir. M, 1 kb DNA merdiveni. Dört cDNA fragmanlarının beklenen boyutları jel görüntüsünün altında belirtilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> /ftp_upload/53164/53164fig3.jpg &quot;/&gt; JEV bir tam boy bir cDNA SA 14 -14-2 ihtiva eden BAC Şekil 3. saflaştırılması. BAC plazmid E. izole edilir SDS-alkalin lisiz yöntemi ile coli DH10B ve ayrıca bir CsCl-EtBr gradyanı şeritleme ile saflaştırılmıştır. 16 × 76 mm yapışmalı polipropilen tüp kullanarak CsCl-EtBr degrade bir örnektir sunulmuştur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53164/53164fig4.jpg" /> JEV SA 14 -14-2 cDNA BAC monte tam uzunlukta bir bulaşıcı virüslerin geri kazanımı Şekil 4. bakış., CDNA şablonunun (A) doğrusallaştırılması. JEV BAC ile kesilir tam uzunluktaXba I ve MBN ile muamele edilmiştir. RNA transkriptlerinin (B) Sentezi. Doğrusallaştırılmış cDNA m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;), bir başlık analogunun varlığında, SP6 RNA polimeraz tarafından transkribe edilmektedir. Sentetik JEVs (C) Kurtarma. In vitro transkripsiyonu RNA&#39;lar sentetik bir virüs titresi yüksek üretir elektroporasyon ile BHK-21 hücrelerine transfekte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53164/53164fig5.jpg" /> Bir cDNA, şablon olarak tam boyda JEV BAC kullanılarak in vitro transkripsiyon Şekil RNA&#39;lar 5. sentezi. Linearize tam uzunlukta JEV BAC, pBAC / SA 14 -14-2 (A) üretimi. PBAC İki bağımsız klon/ SA 14 -14-2 (Cl.1 ve CL.2) MBN ile Xba I ile sindirim ve daha sonra tedavi ile lineerleştirilebilir edilir. Doğrusallaştırılmış BAC% 0.8 agaroz jeli içinde elektroforez ile incelenmiştir. Çoğaltma transkripsiyonu ayrıca, sentetik RNA&#39;ların (B) üretimi. İki linearize BAC&#39;lerin her SP6 RNA polimeraz Çoğaltma transkripsiyonu için bir şablon olarak kullanılır. İki transkripsiyon reaksiyonları alikoları% 0.6 agaroz jeli üzerinde çalıştırılır. M, 1 kb DNA merdiveni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/53164/53164fig6.jpg" /> Tam uzunlukta bir JEV BAC ve sentetik virüsün geri transkribe sentetik RNA&#39;ların Şekil 6. Belirli enfeksiyon. BHK-21 hücreleri, fr türetilmiş RNA transkriptleri ile (Mock), elektroporasyona-sahte veya elektroporasyona olantam uzunlukta JEV BAC (Cl.1 ve CL.2) iki bağımsız klon, her om. (A) RNA enfekte. Hücreler agaroz ile örtüldü ve post-transfeksiyon 4 gün sonra kristal mor ile boyandı. RNA enfekte hücrelerin (sol panel), elektroporasyona enfeksiyöz RNA miktarını tahmin etmek için enfeksiyöz merkezi deneyleri ile belirlenir. Ayrıca enfeksiyonlu merkezlerden temsili görüntüleri (sağ panel) gösterilmiştir. (B) Protein ifadesi. Hücreler 4 oyuklu oda slaytlar kültürlenir. 20 saat post-transfeksiyon (hpt) RNA-elektroporate edilmiş hücrelerde viral protein ifadesi, bir birincil anti-NS1 tavşan antiserumu ve ikincil bir Cy3-konjüge edilmiş keçi anti-tavşan IgG (kırmızı) ile imüno-tahlilleri ile analiz edilir. Çekirdekleri 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (mavi) ile ters. Immunofloresan görüntüleri bunlara karşılık gelen diferansiyel girişim kontrast görüntülerde üst üste. (C) Virüs verimi. Hücreler 1 kültürlenir50 mm kültür yemekleri. 22 ve 40 hpt RNA-electroporated hücrelerinin kültür yüzer biriken enfeksiyöz virionlann üretim plak tahlilleri tarafından incelenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses at JoVE.com

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Bakteriyel Yapay Kromozom: RNA Virüsler Pozitif iplikli Araştırmaları Fonksiyonel Genomik Aracı

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

bacterial-artificial-chromosomes-functional-genomics-tool-for-study

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.2K Görüntüleme.  Utah State University. Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.