This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.

注：このプロトコルは、ボナベンチャーらから適応されました。 （2004）、モリーナら。 （2006）、Liら。 （2013）7,10,11。ステップ1-5は、図1に要約されています。 1.組織脱脂注：必ず使用する前に、ヒュームフードの下で乾燥させる、クロロホルムですべてのガラス器具とキャップをすすぎます。 注意：組織の均質化およびヒュームフードの下にあるすべての溶媒の転送手順を実行します。常に化学物質との直接接触を避けるために、汚染からサンプルを保護するために、実験室のコート、手袋、スプラッシュ安全ゴーグルを着用してください。 <ol><li> 85℃に予熱水浴とヒートブロック。 </li><li>ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）-facedスクリューキャップで予め秤量した20ミリメートル×125 mmのガラス製試験管に各葉サンプルの約0.5グラムを秤量します。サンプルごとに4つの複製を含めます。 </li><li>三角フラスコ（約125ミリリットルに2-プロパノールを置き、SAMPのグラム当たり25ミリリットルル）。 0.01％の最終濃度になるように（また、ブチル化ヒドロキシトルエン、BHTとしても知られる）、2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルフェノールを加える（w / v）の。 注：（BHTは、不飽和脂肪酸の酸化を最小限に抑えることができます）をメタノール中の5％（w / v）のストック溶液からBHTを加えます。 </li><li>水浴中で85℃に予熱2-プロパノール溶液。 </li><li>ヒートブロック中で85℃で15分間、各試料管と熱に12 mlの熱い2-プロパノール溶媒を加えます。このステップは、破壊された細胞から放出され得るリパーゼを不活性化します。 </li><li>チューブを室温まで冷却し、均一な懸濁液が得られるまでホモジナイザーで十分に組織を粉砕してみましょう。 </li><li>オービタルシェーカーでサンプルを置き、100rpmで、室温で1〜2時間振とうします。 </li><li> 800×gで10分間遠心し、上清を捨てます。 </li><li> 2-プロパノールの等量を加え、室温で12時間振とうします。 </li><li> 800×gで10分間遠心し、上清を捨てます。 </li><li> CH 12ミリリットルを追加します。CL 3：CH 3 OH（2：1、V / V）（試料のグラムあたり25 ml）を残渣に100rpmで、室温で一晩振とうします。 </li><li> 800×gで10分間遠心し、上清を捨てます。 </li><li> 12ミリリットルの CHCl 3 を追加 ：CH 3 OH（1：2、v / v）の残基および100 rpmで、室温で一晩振盪し。 </li><li> 800×gで10分間遠心分離し、溶媒を除去します。 </li><li>サンプルは室温で一晩換気フードの下で乾燥させます。 </li><li>残留物を空気は、乾燥した後、無水塩化カルシウムまたは重量が一定に（3~5日）に達するまでのCaSO 4上真空デシケーター中に置きます。 </li></ol> 2.解重合：ナトリウムメトキシドメタノリシス（図2） 注意： - 2.4、2.7から2.8、2.10 - 手順2.3実行2.15と2.17 - - 2.11、2.13ヒュームフードの下で2.18;常に実験室のコート、手袋、スプラッシュ安全ゴーグルを着用してください。 <ol><li> 60℃に予熱ヒートブロック。 </li><li> （さらなる計算のための重要な）乾燥残留物を含む試験管を計量。 </li><li>各チューブに内部標準を追加します：25ωLメチルheptadecanoate（1 mg / mlのストック）と25μlのω-ペンタデカラクトン（1 mg / mlのストック）。 </li><li>各チューブに0.9 mlの酢酸メチル、1.5 mlのナトリウムメトキシド、および3.6 mlのメタノールを追加し、それらをキャップ。あるいは、これら3試薬と反応ミックスを調製し、各サンプルに6 mlのアリコートを追加します。 </li><li> 15分間隔で定期的に60°Cとボルテックスで2時間加熱サンプル。 </li><li>サンプルは室温まで冷却してみましょう。 </li><li>脂肪酸メチルエステルを抽出するために、塩化メチレン（CH 2 Cl 2）と氷酢酸1.5mlを10mlのを追加します。 </li><li>各チューブキャップを充填するために生理食塩水（0.5 MのNaCl）を加えます。 </li><li> 800×gで10分間、1分間遠心のための渦のサンプル。 </li><li>ポリ16×125ミリメートルガラス試験管（中サイズのチューブをきれいにするために、有機相（下）を転送テトラフルオロエチレン（PTFE）-facedスクリューキャップ）。 </li><li>各チューブキャップを充填するために生理食塩水（0.5 MのNaCl）を加えます。 </li><li> 800×gで10分間、1分間遠心のための渦のサンプル。 </li><li>水（上）相を除去し、繰り返しは2.11から2.12までを繰り返します。 </li><li>全ての水性（上）相を削除します。 </li><li>溶媒を無水硫酸ナトリウム（Na 2 SO 4）を加えるチューブにキャップをし、1分間ボルテックス。サンプルは、以下の日まで放置することができる。 この時点で、サンプルは、ヒュームフード下で一晩放置することができます。 </li><li>底の中のNa 2 SO 4塩を圧縮するために800×gで2分間遠心。 </li><li>小さなガラス使い捨て管に有機相を転送（ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）と13×100mmのガラス試験管スクリューキャップを-​​faced）。 </li><li>窒素下で乾燥するまで溶剤を蒸発させ、誘導体化のステップに進みます。すぐに処理されない場合は、ストアは-20℃でサンプルを蒸発させる（サンプルをすることができますLSO）蒸発工程の前に格納されています。 </li></ol>ガスクロマトグラフィーのためのデリバティブの調製注意：ステップ3.1.2と3.1.5を実行 - ヒュームフードの下で3.1.8。常に実験室のコート、手袋、スプラッシュ安全ゴーグルを着用してください。 <ol><li> トリメチルシリル誘導体 <ol><li> 100℃に予熱ヒートブロック。 </li><li>各チューブにピリジンを100μlとBSTFA（N、Oビス - トリメチルシリルトリフルオロ）の100μlを添加して、それらをキャップ。 </li><li> 10分間100℃で熱サンプル。 </li><li>サンプルは室温まで冷却してみましょう。 </li><li>窒素下、室温でサンプルを蒸発させます。試料に熱を加えることを避ける、モノマーは、この段階では非常に揮発性です。 </li><li> 1（v / v）のヘプタン：トルエン1の500μLを追加します。 </li><li> 800×gで2分間の1分と遠心のための渦のサンプル。 </li><li> GCバイアルにサンプルを追加し、GC / MS分析に進みます。 </li></ol></li><li> アセチルデリバティブ 注：アセチル化については、手順を変更する3.1.1-3.1.3上記（ビデオには示されていない）は次の通りです。同じです3.1.4-3.1.8の手順を実行します。 <ol><li> 60℃に予熱ヒートブロック。 </li><li>チューブにピリジン100μlの無水酢酸（C 2 O）の100μLを加えます。 </li><li> 60℃での熱サンプル1時間。 </li></ol></li></ol> 4. GC / MS分析<ol><li> HP-5キャピラリーカラム（30 MX 0.25ミリメートル×0.25μmの膜厚）または同等（すなわち、5％のジフェニル、95％のジメチルポリシロキサン）を使用します。プログラム3℃/分で300℃まで150からプログラムされたヘリウムキャリアガスを1.5ml /分に設定流量とオーブン温度を有するGC。 </li><li>スプリット注入（スプリット比1:10）を使用し、40から600 AMU（電子衝撃イオン化）を介してモードをスキャンする質量分析計を設定します。 </li><li>示さクチン分析法を用いて、それぞれ、WTおよび変異体の複製、（空白）は、溶媒を含むシーケンステーブルを作成します。 </li><li>ロード溶剤そして、カルーセル上のサンプルバイアルは、必要に応じてオートサンプラシリンジすすぎバイアルにヘキサンを追加して、シーケンスを開始します。シーケンスが完了した後、全イオンクロマトグラムのトレースは、すべてのサンプルのために利用可能です。 </li></ol> 5.データ解析<ol><li>公開された質量スペクトルの各ピークのマススペクトルを比較することによって、または使用可能な場合は、市販のライブラリーを検索することにより、脂質ポリエステルモノマーを特定します。 </li><li>総イオン電流クロマトグラムの各識別されたピークについて、GC / MSソフトウェア（ 補足図1）からの積分結果テーブル上の領域を見つけるために、それぞれの保持時間を使用しています。 </li><li>各単量体（カラムA-B）については、あるモノマーのExcelのテーブル（ 補足ファイル2、カラムCF）、サンプルを複製するすべてのための対応する列に統合テーブル（ 補足図1、列D）で見つかった面積値を追加シロイヌナズナを定量化するために、スプレッドシートクチンTMSI誘導体。アセチル化誘導体が代わりに用意されている場合は、補足ファイル3を使用してください 。 </li><li> ISカラム（HK）への内部標準（IS）の領域を追加します。それらの誘導体化されていない単量体、すなわち、脂肪酸メチルエステル（FAME）、およびジカルボン酸ジメチルエステル（DCAのDME）については、17を使用します。モノマーテーブル内の紫色の網掛けセルは（定量化のためにISとして0 FAME（IS1）を、 補足ファイル2/3）。第一級アルコール、フェルラ酸、ωヒドロキシ酸を含むヒドロキシルモノマーについては、15を使用します化合物の定量化のための選択であるとして、0〜15ヒドロキシFAME（IS2）を（モノマーテーブル内の緑shadded細胞; 補足ファイル2/3） 。 </li><li>それぞれが列AX-BA（ 補足ファイル2）またはAQ-AT（ 補足ファイル3）に複製するための乾燥葉の重量を追加します。代替的に、単位当たりのモノマーの負荷を表現するために表面積を計算し、モノマーのテーブルに面積値を追加するために、葉をスキャン表面積。 </li></ol>

<ol><li>Kolattukudy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopolyester+membranes+of+plants%3A+cutin+and+suberin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biopolyester membranes of plants: cutin and suberin.</a> Science. 208 (4447), 990-1000 (1980).</li>
<li>Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyesters+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+Biot%22%5BJournal%5D)">Polyesters in higher plants.</a> Adv. Biochem. Eng. Biot. 71, 1-49 (2001).</li>
<li>Yeats, T. H., Rose, J. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+and+function+of+plant+cuticles%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The formation and function of plant cuticles.</a> Plant Physiol. 163 (1), 5-20 (2013).</li>
<li>Pollard, M., Beisson, F., Li, Y., Ohlrogge, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+lipid+barriers%3A+biosynthesis+of+cutin+and+suberin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Building lipid barriers: biosynthesis of cutin and suberin.</a> Trends Plant Sci. 13 (5), 236-246 (2008).</li>
<li>Beisson, F., Li-Beisson, Y., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solving+the+puzzles+of+cutin+and+suberin+polymer+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Solving the puzzles of cutin and suberin polymer biosynthesis.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 15 (3), 329-337 (2012).</li>
<li>Heredia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+and+biochemical+characteristics+of+cutin%2C+a+plant+barrier+biopolymer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Biophysical and biochemical characteristics of cutin, a plant barrier biopolymer.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1620 (1-3), 1-7 (2003).</li>
<li>Bonaventure, G., Beisson, F., Ohlrogge, J., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+aliphatic+monomer+composition+of+polyesters+associated+with+Arabidopsis+epidermis%3A+occurrence+of+octadeca-cis-6%2C+cis-9-diene-1%2C+18-dioate+as+the+major+component%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of the aliphatic monomer composition of polyesters associated with Arabidopsis epidermis: occurrence of octadeca-cis-6, cis-9-diene-1, 18-dioate as the major component.</a> Plant J. 40 (6), 920-930 (2004).</li>
<li>Franke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoplastic+polyesters+in+Arabidopsis+surface+tissues+-+A+typical+suberin+and+a+particular+cutin%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Apoplastic polyesters in Arabidopsis surface tissues - A typical suberin and a particular cutin.</a> Phytochemistry. 66 (22), 2643-2658 (2005).</li>
<li>Vogg, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+fruit+cuticular+waxes+and+their+effects+on+transpiration+barrier+properties%3A+functional+characterization+of+a+mutant+deficient+in+a+very-long-chain+fatty+acid+-ketoacyl-CoA+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Tomato fruit cuticular waxes and their effects on transpiration barrier properties: functional characterization of a mutant deficient in a very-long-chain fatty acid -ketoacyl-CoA synthase.</a> J. Exp. Bot. 55 (401), 1401-1410 (2004).</li>
<li>Molina, I., Bonaventure, G., Ohlrogge, J., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+polyester+composition+of+Arabidopsis+thaliana+and+Brassica+napus+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">The lipid polyester composition of Arabidopsis thaliana and Brassica napus seeds.</a> Phytochemistry. 67 (23), 2597-2610 (2006).</li>
<li>Li-Beisson, Y., et al. Acyl-lipid metabolism. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi-Beisson%2C+Y+%22The+Arabidopsis+Book%22">The Arabidopsis Book</a>. 11, e0161(2013).</li>
<li>Christie, W. W. Mass Spectrometry of Fatty Acid Derivatives. , LipidHome. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.lipidhome.co.uk/ms/masspec.html">http://www.lipidhome.co.uk/ms/masspec.html</a> (2015).</li>
<li>Molina, I., Ohlrogge, J. B., Pollard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deposition+and+localization+of+lipid+polyester+in+developing+seeds+of+Brassica+napus+and+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Deposition and localization of lipid polyester in developing seeds of Brassica napus and Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 53 (3), 437-449 (2008).</li>
<li>Xiao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+CYP86A2+represses+Pseudomonas+syringae+type+III+genes+and+is+required+for+cuticle+development%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis CYP86A2 represses Pseudomonas syringae type III genes and is required for cuticle development.</a> EMBO J. 23 (14), 2903-2913 (2004).</li>
<li>Christie, W. W., Han, X. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChristie%2C+WW+%22Lipid+Analysis+-+Isolation%2C+Separation%2C+Identification+and+Lipidomic+Analysis%22">Lipid Analysis - Isolation, Separation, Identification and Lipidomic Analysis</a>. , 4th edition, Oily Press. Bridgwater, U.K. 446(2010).</li>
<li>Walton, T. J., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+structures+of+cutin+monomers+by+a+novel+depolymerization+procedure+and+combined+gas+chromatography+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of the structures of cutin monomers by a novel depolymerization procedure and combined gas chromatography and mass spectrometry.</a> Biochemistry. 11 (10), 1885-1896 (1972).</li>
<li>Matzke, K., Riederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+into+the+chemical+constitution+of+cutins+and+suberins+from+Picea+abies+%28L.%29+Karst.%2C+Quercus+robur+L.%2C+and+Fagus+sylvatica+L%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">A comparative study into the chemical constitution of cutins and suberins from Picea abies (L.) Karst., Quercus robur L., and Fagus sylvatica L.</a> Planta. 185 (2), 233-245 (1991).</li>
<li>Riederer, M., Schönherr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+gas+chromatographic+analysis+of+methyl+esters+of+hydroxy+fatty+acids+derived+from+plant+cutin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Quantitative gas chromatographic analysis of methyl esters of hydroxy fatty acids derived from plant cutin.</a> J. Chromatogr. 360, 151-161 (1986).</li>
<li>Moire, L., Schmutz, A., Buchala, A., Yan, B., Stark, R., Ryser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycerol+Is+a+Suberin+Monomer.+New+Experimental+Evidence+for+an+Old+Hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glycerol Is a Suberin Monomer. New Experimental Evidence for an Old Hypothesis.</a> Plant Physiol. 119 (3), 1137-1146 (1999).</li>
<li>Graça, J., Schreiber, L., Rodrigues, J., Pereira, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycerol+and+glyceryl+esters+of+omega-hydroxyacids+in+cutins%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Glycerol and glyceryl esters of omega-hydroxyacids in cutins.</a> Phytochemistry. 61 (2), 205-215 (2002).</li>
<li>Eglinton, G., Hunneman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+chromatographic-mass+spectrometric+studies+of+long+chain+hydroxy+acids-I%3A+The+constituent+cutin+acids+of+apple+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Gas chromatographic-mass spectrometric studies of long chain hydroxy acids-I: The constituent cutin acids of apple cuticle.</a> Phytochemistry. 7 (2), 313-322 (1968).</li>
<li>Espelie, K. E., Köller, W., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((9%2C16-dihydroxy-10-oxo-hexadecanoic+acid%2C+a+novel+component+in+citrus+cutin%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">9,16-dihydroxy-10-oxo-hexadecanoic acid, a novel component in citrus cutin.</a> Chem. Phys. Lipids. 32 (1), 13-26 (1983).</li>
<li>Holloway, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracuticular+lipids+of+spinach+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Intracuticular lipids of spinach leaves.</a> Phytochemistry. 13 (10), 2201-2207 (1974).</li>
<li>Holloway, P. J., Deas, A. H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxyoctadecanoic+acids+in+plant+cutins+and+suberins%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Epoxyoctadecanoic acids in plant cutins and suberins.</a> Phytochemistry. 12 (7), 1721-1735 (1973).</li>
<li>Holloway, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolloway%2C+PJ+%22The+chemical+constitution+of+plant+cutins%22">The chemical constitution of plant cutins</a>. Cutler, D. F., Alvin, K. L., Price, C. E. , Academic Press. London. 45-85 (1982).</li>
<li>Croteau, R., Fagerson, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+constituent+cutin+acids+of+cranberry+cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">The constituent cutin acids of cranberry cuticle.</a> Phytochemistry. 11 (1), 353-363 (1972).</li>
</ol>

No conflicts of interest declared.

DNAやタンパク質などの生体高分子、他のとは異なり、植物脂質のポリエステルは、テンプレートから作られていません。代わりに、その組成物は、これらの細胞外ポリマーを製造するための組織に存在する酵素の特異性に依存します。このように、構成成分の化学分析は、脂質のポリエステル組成物を理解することが重要です。 エステル結合を切断するための化学的方法は、ケン化、水素化分解、酸触媒トランスメチレーション、および塩基触媒トランスメチレーション2を含みます 。それらの各々は、長所と短所を有しています。鹸化は、二次反応を受けることができる遊離脂肪酸ヒドロキシ酸を生成します。水素化アルミニウムリチウム（LiAlH 4を）と水素化分解16は、クチン解析7に使用されています。水素化分解は、アルコールに官能基化炭素を減少させ、元の構造は、重水素化リチウムアルミニウム（LiAlD 4）でdeuteriolysisによって推論される必要があります。ザ・このアプローチの欠点は、それらの構造の割り当てを行うために得られる脂肪ポリオールのdeuteriationの程度を比較するための高分解能GC / MSの要件です。メタノール三フッ化ホウ素（BF 3）との酸触媒エステル交換を頻繁にクチンおよびスベリン8,17,18解重合に使用されてきたが、試薬は、限定された貯蔵寿命を有し、そして反応を15側に起因するアーチファクトを導入することができます。メタノール硫酸また、モノマーのメチルエステルが得られるが、おそらく、他の方法10に比べ、真の脂質ポリエステル成分でない2-ヒドロキシ脂肪酸のより大きな割合を有します。 このプロトコールに記載のNaOMe触媒によるエステル交換法は、識別のための特徴的な質量スペクトルを提供し、ヒドロキシル基のシリル化によって誘導体化された脂肪酸メチルエステルを生成し、またはアセチル化によってfoのヒドロキシル基のより安定な誘導体を提供することR定量。この技術の一つの欠点は、水が反応中に存在する場合、加水分解は、エステル交換反応と競合することです。水は、のNaOMe（触媒）と反応し、次いで、遊離酸（ 図2D）を得た脂肪酸メチルエステルを加水分解水酸化ナトリウムを生成します。したがって、分析を複雑に、メチルエステルおよびTMSIエステル誘導体：2つのピークが、各脂肪酸のために存在するので、これは望ましくない副反応です。無水の試薬 ​​を使用し、ケン化に対抗するために共溶媒として酢酸メチルを添加することは、加水分解（ 図2D）を防止することが重要なステップです。 クチンおよびスベリンは1と26％グリセロール4との間に含まれています。しかしながら、このモノマーは、このプロトコルに記載された実験条件では検出されないであろう。グリセロールは、脂肪酸メチルエステルモノマーとは異なり、水性溶媒洗浄工程中に除去される、高度に親水性であり、。この制限は、クチン他の解重合方法にpplies、グリセロール、酵素法を用いてエステル交換した後、得られた水層に決定することができます。あるいは、グリセロール定量化の目的のために有用な.Althoughグリセロール19,20を含む全てのモノマーを検出するためにさらに水抽出することなく、より穏やかな条件（ 例えば 、0.05 MのNaOMe）を用いて定量することができ、穏やかな条件は、通常、クチンの不完全な解重合を与えますスベリン。 炎イオン化検出器（FID）に結合されたGCが利用可能である場合の代表的な試料のピークは、GC / MSによって同定された後、すべての複製は、定量的な目的のために、この機器で分析することができます。それらの保持指標が知られている場合は別の方法として、GC / FIDトレース中のモノマーを特定することができます。水素炎イオン化検出器は、特に高感度、メジャーとマイナーの試料成分の定量化のために重要である比例の広い範囲を持っていますシングルランインチまた、堅牢で維持し、15を操作しやすいです。 記載されたプロトコルは、一つ以上の脂質ポリエステルモノマーの組成が異なる変異体の化学的な特徴付けを可能にする、植物脂質のポリエステルモノマーの信頼性と再現性の分離、同定、および定量を可能にします。手続きは、それが容易に根、種子、葉、茎、花などの種々の植物材料の小さなバルクの両方の量を処理するように適合させることができる、拡張可能です。多くの種からの脂質ポリエステルモノマーの質量スペクトルデータは、 例えば公開されている。、21-26と他の組織および/ ​​または種にこのプロトコルを適応させる際に、未知の単量体を識別するために貴重なリソースを構成しています。この方法は、高等植物における脂質ポリエステルの生合成、調節、及び分布の調査に適用可能です。

維管束植物は、植物組織と外部環境との間の防水障壁として機能する細胞外の層に依存しています。これらの親油性の細胞壁に関連する構造は、病原体感染を制限し、および植物組織1からのガス、水および溶解した物質の受動輸送を調節します。このような障壁は、植物のクチクラ、植物2、および異なるスベリン含有拡散バリアに固有synapomorphic構造です。キューティクルは、細胞壁3-5の細胞外側にペクチンの層を介して上皮細胞により合成され、それらに結合した親油性層です。これは、植物組織と環境との間の重要なインターフェースとして機能し、高等植物の主要な空中臓器を包みます。 クチン、キューティクルの構造マトリックス、およびスベリンは、溶媒抽出ワックス2,4に関連する2つの不溶性グリセロポリエステルです。これらの高分子リットルipidsは、飽和および不飽和脂肪酸誘導体で構成され、両方の構造的および機能的に類似しているされています。しかし、彼らは化学組成と堆積サイトでの特性差によって区別されています。 スベリンは、二次壁を形成する特定の外部と内部組織の細胞壁の内側に位置する脂肪族ポリエステルです。 Suberized組織が ​​根、塊茎および樹皮のperiderms、根の内皮、種 ​​皮層、および癒さ傷2を含みます 。クチンとは異なり、スベリンポリエステルは、一般的に、アルコール、飽和およびモノ不飽和ジカルボン酸、および超長鎖モノマー（C≥20）の大部分が含まれています。 クチンは、維管束植物6で最も豊富な脂質ポリエステルであり、グリセロールおよび、ヒドロキシおよびヒドロキシ置換されたエポキシ脂肪酸4としてC16-C18 interesterified脂肪酸誘導体、から構成されています。クチンポリマーの組成をしながら0、18 - ヒドロキシ-9,10-エポキシ18：0、および9,10,18トリヒドロキシ18：0脂肪酸維管束植物種間で異なり、最も優勢な主要なモノマーは、10、16ジヒドロキシ16です。 2ジカルボン酸7,8：興味深いことに、シロイヌナズナの葉とクチン茎は主に18から構成されています。 植物のキューティクルも数ナノメートルから数マイクロメートル9までの範囲、厚さにかなりのばらつきを示します。キューティクル分離は特に、 シロイヌナズナ 8のものと非常に薄い葉のクチクラのための労力と時間のかかるステップであるため、キューティクルの分離を回避する方法が開発され、7,8を検証されています。ここでは、ナトリウムメトキシド（NaOMeの）触媒解重合とそれに続くガスクロマトグラフィー/質量分析（GC / MS）分析によりシロイヌナズナの葉におけるクチンのモノマー組成物を研究するための詳細なプロトコルを記述する。このプロトコルは、共同をアッセイするための堅牢な方法を提供しています全体脱脂組織における植物脂質ポリエステルのmposition、とは、以前に報告されたプロトコル7,10,11から適応されています。全組織サンプルは、クチクラとエピクチクラワックス、膜脂質、およびトリアシルグリセロールを含む溶剤抽出脂質を除去し、均質化された第一及び徹底的に脱脂されています。細胞壁に富む残渣を、次いでナトリウムメトキシドで触​​媒メタノリシスによってそれらの構成メチルエステルモノマーに解重合されます。脂肪酸メチルエステルは、酸性化時に抽出され、それらの対応するトリメチルシリルまたはアセチル誘導体​​を得るために誘導体化されます。誘導体化された残基は、高度に揮発性であり、およびGC / MS分析の間にその構造コンフォメーションを変更することなく、妥当な温度でのガスクロマトグラフィーカラムから溶出することができます。

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BPA451-4</td><td>Solvent for delipidation</td></tr><tr><td>Anhydrous sodium sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>S421500</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320102</td><td>Derivatization agent</td></tr><tr><td>BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15222</td><td>Derivatization agent</td></tr><tr><td>Butylated hydroxytoluene (BHT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101162</td><td>Antioxidant</td></tr><tr><td>Calcium chloride, anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-3</td><td>Desiccation agent</td></tr><tr><td>Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator)</td><td>Acros Organics</td><td>219090020</td><td>Desiccation agent</td></tr><tr><td>Chloroform (Trichloromethane)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C6074</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2401212</td><td>Acidification agent</td></tr><tr><td>Helium carrier gas, compressed</td><td>Air Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1046</td><td>Carrier gas, GC/MS</td></tr><tr><td>Heptane</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3501</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Hexanes</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3024</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4124</td><td>Organic solvent, transmethylation reactive</td></tr><tr><td>Methyl acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296996</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Methyl heptadecanoate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4515</td><td>Internal standard (1mg/mL stock)</td></tr><tr><td>Methylene dichloride (Dichloromethane)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D374</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Nitrogen, compressed</td><td>Air Liquide</td><td>ALPHAGAZ1-UN1044</td><td>Carrier gas, GC-FID</td></tr><tr><td>Pentadecanolactone</td><td>Fluka</td><td>76530</td><td>Internal standard (1 mg/ml stock)</td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td>Co-solvent for derivatization</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358212</td><td>Saline solution</td></tr><tr><td>Sodium methoxide (25wt.%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>156256</td><td>Nucleophile</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>FIsher Scientific</td><td>T2904</td><td>Organic solvent</td></tr><tr><td>Plant Growth Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pro-Mix PGX</td><td>Premier Tech Horticulture Ltd</td><td></td><td>Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2)&lt;br/&gt; Purdue Methods for Arabidopsis Growth.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PermaNest Humidity Dome&amp;nbsp;</td><td>Grower&#039;s Solution, LLC, Cookeville, TN&amp;nbsp;</td><td>GD2211-24</td><td></td></tr><tr><td>Perma-Nest Plant Trays (22x11in)</td><td>Grower&#039;s Solution, LLC, Cookeville, TN&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Square greenhouse pots, 3.5 inch&amp;nbsp;</td><td>Grower&#039;s Solution, LLC, Cookeville, TN&amp;nbsp;</td><td>P86</td><td></td></tr><tr><td>General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20</td><td>Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glassware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-13100</td><td></td></tr><tr><td>16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-16125</td><td></td></tr><tr><td>20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap</td><td>Kimble Chase Life Science and Research Products LLC</td><td>45066A-20125</td><td></td></tr><tr><td>GC vial caps</td><td>National Scientific</td><td>C400051A</td><td></td></tr><tr><td>GC vial microinserts</td><td>National Scientific</td><td>C4011631</td><td></td></tr><tr><td>GC vials</td><td>National Scientific</td><td>C40001</td><td></td></tr><tr><td>Disposable pasteur pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820B</td><td></td></tr><tr><td>Flasks</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allegra X15R centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytic balance</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Belly dancer</td><td></td><td></td><td>A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available</td></tr><tr><td>DB-5 Capillary GC column</td><td>J&amp;amp;W Scientific, CA, USA;&amp;nbsp;</td><td></td><td>30 m x 0.25 mm x 0.25 &amp;mu;m film thickness</td></tr><tr><td>Desiccator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 202 water bath</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISQ LT single quadupole mass spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat block</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen evaporator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron homogenizer</td><td>Birkmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trace 1300 gas chromatograph</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Two-stage regulator</td><td>Air Liquide</td><td>Q1-318B-580</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum desiccator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and compositional analysis of plant cuticle lipid polyester monomers

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.

。10日-この原稿に記載されているプロトコル脂質ポリエステルモノマーを決定するように設定されている（ すなわち 、クチンまたはスベリン）、非クチン脂質10の貢献を最小化図1は、完全に8の間にかかるアッセイの概要を説明します（最初の組織の収穫からのGCデータを得るために）、乾燥させているどのくらいのサンプルに応じて。 選択された塩基触媒メタノリシス（ 図2）のポリエステルを解重合する方法は、以前クチンおよびスベリンの両方が含まれているシロイヌナズナの種子のために検証されました。組織は、最初に均質化し、徹底的に溶剤抽出脂質を除去するために脱脂されています。抽出後の残渣の収率は、最初の新鮮重量の割合として、通常Aの 6％ですシロイヌナズナ COL-0の葉。細胞壁に富む残渣を真空デシケーター中で乾燥した後、それらの構成によってメチルエステルモノマーに解重合されています塩基触媒トランスメチレーション。 2時間のインキュベーションは、適切な解重合および脂質ポリエステル成分の回収のために必要な重要な時期として選ばれました。より長いインキュベーション時間は、2-ヒドロキシ酸の増加をもたらしました。これらは、潜在的に、膜スフィンゴ脂質10から派生。 シロイヌナズナ野生型の葉クチンはO -TMSiエーテル誘導体（ 図3A）及びO -アセチル誘導体（ 図3B）は、 図3に示されている場合の典型的なクロマトグラム。各ピークは、文献7,8および12。当社のビデオプロトコルは、TMSIの誘導体を製造する方法を示して公共データベースからの質量スペクトルとの比較により同定したが、サンプルが代わりにヒドロキシル基を誘導体化するアセチル化することができます。彼らは診断マススペクトルを与えるため、シリル化誘導体は、識別の目的のために良いです。しかし、アセチル化誘導体は、より安定したシリル化に良い代替されています一度モノマーは、10を同定されています。唯一のGCは、水素炎イオン化検出器（FID）に結合されている実験室でこのプロトコルの実装を支援するために、GC / FIDをWT葉クチンモノマーの脂肪酸メチルエステルの標準同族系列のアセチル化誘導体に対応するも示されているトレース（ 補足図4）。 この方法は、定性的であり、変異体解析のためにその値したがって、サンプル間の定量的な差を検出します。個々のモノマーの量は、サンプル間のモノマーの存在量の比較を可能にする、定量化の内部標準法を用いて決定されます。これは、ピークの大きさ（総イオンカウント数）は、ポリエステル中のモノマーのモル比を反映していない可能性があること、しかし、明確にする必要があります。我々は、脂肪酸メチルエステルおよびTMSI誘導体（ 補足ファイル1）、またはエースとしてシロイヌナズナ葉クチン中のモノマー量を計算するために、モノマーの編集可能なテーブルを含むされています<html>アルコールのティル誘導体（ 補足ファイル2）。これらの表は、サンプルが異なる器官または植物種から抽出された場合に適応する必要があるかもしれません。 例として、我々はシロイヌナズナタリアナコロンビア（COL-0）は、野生型の葉とCYP86A2 / ATT1遺伝子の2つの以前に特徴付けヌル変異対立遺伝子、att1-1（M-1）とatt1-2（M-2を分析しました ）13,14。 CYP86AサブファミリーのシトクロムP450モノオキシゲナーゼは、推定ω-oxydasesをエンコードし、スベリンおよびクチンモノマー生合成に参加しています。我々の結果（ 図4）は 、WTの葉に比べて、変異体の葉における三大脂質モノマーの負荷の大幅な削減を実証します。 、酵素の予測機能と一致して16：0、18：2、および18：1ジカルボキシレートは、特にATT1変異体において影響を受けました。 「SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 53386 / 53386fig1.jpg&quot; /&gt; 脂質ポリエステルの分析1.概要図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig2.jpg" /> NaOMeを触媒によるメチル基転移反応の図2機構求核メトキシアニオンを容易に脂肪酸メチルエステルおよびアルコキシドアニオン（B）に解離する不安定な四面体中間体（A）を形成する脂質ポリエステルのcabonyl炭素を攻撃します。これらのアルコキシドは共役塩基であり、それによって追加の解重合反応（C）の維持、触媒的に活性なメトキシアニオンを再生する、メタノールと反応します。水が中に存在する場合システムには、水酸化ナトリウム、不可逆的に望ましくない遊離脂肪酸を生成するためにエステルを加水分解強塩基を形成するために、ナトリウムメトキシドと反応します。酢酸メチルは、システム（D）の中に、水酸化ナトリウムの少量を削除するには、15共溶媒として追加されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig3.jpg" /> 図3。野生型シロイヌナズナの葉クチンモノマーの代表的なトータルイオンクロマトグラム。（A）O -trimethylsilyl（TMSI）エーテルと、（B）、酢酸ヒドロキシル誘導体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> </A&gt; <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53386/53386fig4.jpg" /> 図シロイヌナズナ WTの4クチンモノマー組成及びCYP86A2遺伝子の2つのヌル変異体対立遺伝子（ 変異1 = att1-1;変異2 = att1-2）。エラーバーは平均の標準偏差を示す（N = 4） 。 ©ブラックウェルパブリッシング（2007）の許可を得て、13から適応。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/53386fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig1.jpg" /> GC / MSソフトウェアから補足図1のピーク積分結果テーブル。同定された単量体と内部標準に対応するピークは、彼らのretentiによって識別されます<html>時間に（列C）及び面積値が列Dに表にし<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_1.tif" target="_blank">、このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig2.jpg" /> シロイヌナズナクチンモノマー（ヒドロキシ脂肪酸メチルエステルのトリメチルシリルエーテル誘導体）の補足ファイル2.表。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_File_2_Cutin_template_TMSi.xls" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig3.jpg" /> シロイヌナズナクチンモノマー（ヒドロキシ脂肪酸メチルエステルのOアセチル誘導体）の補足ファイル3表。COM /ファイル/ ftp_upload / 53386 / Supplemental_File_3_Cutin_template_Acetylated_derivati​​ves.xlsx「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53386/53386supfig4.jpg" /> （AB）脂肪酸メチルエステル（FAME）リテンションインデックススタンダード（ピークは各飽和FAME鎖長で標識される）の補足図4 GC / FIDトレース。及び（C）は、A をアセチル化WT シロイヌナズナ葉クチンモノマー。 16：0 FAME（1）、フェルラ酸（2）、18：3 FAME（3）、18：1/18：2のFAME（4）、18（5）、sinapate 0 FAME（6ピーク上の数字は、対応します）、16：0 DCA（7）、16-OH 16：0 FAME（8）、18：2 DCA（9）、18：1 DCA（10）18：0 DCA（11）、18-OH 18：2 FAME（12）、18-OH 18：1 FAME（13）、20：0 FAME（14）、10,16-DIOH 16：0 FAME（15）、24：0 FAME（16）。 DCA：ジカルボン酸ジメチルエステル。 FAME：脂肪酸メチルエステル。 IS1：内部標準1、17：0 FAME。 IS2：内部STandard 2、15-OH 15：0 FAME。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53386/Supplemental_Figure_4.tif" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers at JoVE.com

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

植物キューティクル脂質ポリエステルモノマーの単離と組成分析

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

isolation-compositional-analysis-plant-cuticle-lipid-polyester

Universidad Científica del Sur

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K ビュー.  Algoma University. Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

ビデオ: Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

グラム陰性菌からの単離とリピドAの化学特性評価

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

化学

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the face of turgor pressures several atmospheres in magnitude. Across the diverse shapes and sizes of the bacterial kingdom, the cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by short peptides. Peptidoglycan&#8217;s central importance to bacterial physiology underlies its use as an antibiotic target and has motivated genetic, structural, and cell biological studies of how it is robustly assembled during growth and division. Nonetheless, extensive investigations are still required to fully characterize the key enzymatic activities in peptidoglycan synthesis and the chemical composition of bacterial cell walls. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is a powerful analytical method for quantifying differences in the chemical composition of the walls of bacteria grown under a variety of environmental and genetic conditions, but its throughput is often limited. Here, we present a straightforward procedure for the isolation and preparation of bacterial cell walls for biological analyses of peptidoglycan via HPLC and Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), an extension of HPLC that utilizes pumps to deliver ultra-high pressures of up to 15,000 psi, compared with 6,000 psi for HPLC. In combination with the preparation of bacterial cell walls presented here, the low-volume sample injectors, detectors with high sampling rates, smaller sample volumes, and shorter run times of UPLC will enable high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition and fundamental bacterial cell biology in most biological laboratories with access to an ultracentrifuge and UPLC.

The bacterial cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by peptides. Ultra Performance Liquid Chromatography provides high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition. We present a procedure for the isolation of cell walls (sacculi) and their subsequent preparation for analysis via UPLC.

超高性能液体クロマトグラフィーによる組成解析のための細菌細胞壁の分離と調製

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Use of Arabidopsis eceriferum Mutants to Explore Plant Cuticle Biosynthesis

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms.  The cuticle is made up of a tough crosslinked polymer called "cutin" and a protective wax layer that seals the plant surface.  The waxy layer of the cuticle is obvious on many plants, appearing as a shiny film on the ivy leaf or as a dusty outer covering on the surface of a grape or a cabbage leaf thanks to light scattering crystals present in the wax.  Because the cuticle is an essential adaptation of plants to a terrestrial environment, understanding the genes involved in plant cuticle formation has applications in both agriculture and forestry. Today, we'll show the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.


The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation but is also an important barrier against the entry of pathogenic microorganisms. In this video, we demonstrate the analysis of plant cuticle mutants identified by forward and reverse genetics approaches.

植物のキューティクルの生合成を探検するシロイヌナズナeceriferum変異体の使用

The plant cuticle is a waxy outer covering on plants that has a primary role in water conservation, but is also an important barrier against the entry of ...

生物学

Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles

Reptiles signal to conspecifics using lipids in their skin, primarily to enable mate tracking and assessment. The isolation of these lipids has utility in research focused on evolutionary patterns and mechanisms of chemical communication, in addition to understanding the waterproofing role of lipids in the evolution of terrestrial life. In an applied approach, such skin-based cues have potential use for wildlife managers dealing with invasive species. The main steps for quantifying reptile skin lipids in the protocol presented here include extraction, total lipid determination, and fractionation via column chromatography, the latter process resulting in purified eluates of compounds which can then either be analyzed to assign compound identifications (e.g., gas chromatography-mass spectrometry [GC-MS]) and/or used directly in more refined bioassays. Skin lipids can be extracted from living skin, shed skin, or dead whole animals, using nonpolar organic solvents (e.g., hexane, benzene, toluene). Extraction solubilizes the lipids and, then, the solvent can be evaporated to yield a measurable lipid-only extract. Fractionation involves the separation of the total lipid extract into specific eluates via traditional column chromatography. The total lipid extract is first bound to a substrate-based column (e.g., alumina) and, then, individual eluates (&#34;fractions&#34;) of solvent at specific volumes are passed sequentially through the column to elute sets of compounds from the lipid mixture based on common polarity. The fractions progress in polarity at a standardized sequence by increasing the relative amount of polar solvent (e.g., diethyl ether) in nonpolar solvent. In this manuscript, we describe several methods for extracting skin lipids of reptiles and, then, provide a standard protocol for isolating different sets of compounds based on polarity, using traditional column chromatography. Whole lipid extracts or specific fractions can, then, be used in bioassays to determine any biological activity elicited by the compounds therein.

In reptiles, skin lipids from conspecifics are crucial for sexual signaling, with potential use in invasive species management. Here, we describe protocols for extracting skin lipids from shed skin or whole animals, determining and analyzing the total lipid mass, and separating the lipids using fractionation via column chromatography.

爬虫類から皮膚脂質の分離、定量、化学分離

Reptiles signal to conspecifics using lipids in their skin, primarily to enable mate tracking and assessment. The isolation of these lipids has utility in ...

環境学

Extraction of Lignin with High &#946;-O-4 Content by Mild Ethanol Extraction and Its Effect on the Depolymerization Yield

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the emerging elegant procedures to obtain specific aromatic products rely on the lignin substrate having a high content of the readily cleavable &#946;-O-4 linkage as present in the native lignin structure. This provides a miss-match with typical technical lignins that are highly degraded and therefore are low in &#946;-O-4 linkages. Therefore, the extraction yields, and the quality of the obtained lignin are of utmost importance to access new lignin valorization pathways. In this manuscript, a simple protocol is presented to obtain lignins with high &#946;-O-4 content by relatively mild ethanol extraction that can be applied to different lignocellulose sources. Furthermore, analysis procedures to determine the quality of the lignins are presented together with a depolymerization protocol that yields specific phenolic 2-arylmethyl-1,3-dioxolanes, which can be used to evaluate the obtained lignins. The presented results demonstrate the link between lignin quality and potential for the lignins to be depolymerized into specific monomeric aromatic chemicals. Overall, the extraction and depolymerization demonstrates a trade-off between the lignin extraction yield and the retention of the native aryl-ether structure and thus the potential of the lignin to be used as the substrate for the production of chemicals for higher-value applications.

Here, we present a protocol to perform ethanol extraction of lignin from several biomass sources. The effect of the extraction conditions on the lignin yield and &#946;-O-4 content are presented. Selective depolymerization is performed on the obtained lignins to obtain high aromatic monomer products.

高 β-O-4 コンテンツによるリグニンの抽出軽度エタノール抽出と脱重合の収量に及ぼす影響

Lignin valorization strategies are a key factor for achieving more economically competitive biorefineries based on lignocellulosic biomass. Most of the ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation1 and other products such as biocomposite materials7. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses (matrix polysaccharides, and the polyphenol lignin6 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls provide tensile strength to cells and the entire plants, ward off pathogens, and allow water to be transported throughout the plant; in the case of trees up to more the 100 m above ground level. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerization by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis. In this first part we focus on the analysis of the polyphenol lignin (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its lignin content by acetylbromide solubilization3, and its lignin composition in terms of its syringyl, guaiacyl- and p-hydroxyphenyl units5. The protocol for analyzing the carbohydrates in lignocellulosic biomass including cellulose content and matrix polysaccharide composition is discussed in Part II2.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of the polyphenolic lignin.

植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートI：リグニン

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートII：炭水化物

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine, form bilayer membranes which act as both boundaries and interfaces for chemical exchange between cells and their surroundings. Unlike animals, plant cells have a special organelle for photosynthesis, the chloroplast. The intricate membrane system of the chloroplast contains unique glycerolipids, namely glycolipids lacking phosphorus: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG)4. The roles of these lipids are beyond simply structural. These glycolipids and other glycerolipids were found in the crystal structures of photosystem I and II indicating the involvement of glycerolipids in photosynthesis8,11. During phosphate starvation, DGDG is transferred to extraplastidic membranes to compensate the loss of phospholipids9,12.
Much of our knowledge of the biosynthesis and function of these lipids has been derived from a combination of genetic and biochemical studies with Arabidopsis thaliana14. During these studies, a simple procedure for the analysis of polar lipids has been essential for the screening and analysis of lipid mutants and will be outlined in detail. A leaf lipid extract is first separated by thin layer chromatography (TLC) and glycerolipids are stained reversibly with iodine vapor. The individual lipids are scraped from the TLC plate and converted to fatty acyl methylesters (FAMEs), which are analyzed by gas-liquid chromatography coupled with flame ionization detection (FID-GLC) (Figure 1). This method has been proven to be a reliable tool for mutant screening. For example, the tgd1,2,3,4 endoplasmic reticulum-to-plastid lipid trafficking mutants were discovered based on the accumulation of an abnormal galactoglycerolipid: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) and a decrease in the relative amount of 18:3 (carbons : double bonds) fatty acyl groups in membrane lipids 3,13,18,20. This method is also applicable for determining enzymatic activities of proteins using lipids as substrate6.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Composition of polar lipid extracts and the fatty acid composition of individual glycerolipids are determined in a simple and robust lipid profiling experiment. For this purpose, glycerolipids are isolated by thin layer chromatography and subjected to transmethylation of their acyl groups. Fatty acyl methylesters are quantified by gas-liquid chromatography.

気-液クロマトグラフィー（GLC）とあいまって薄層クロマトグラフィー（TLC）によりシロイヌナズナポーラーグリセロ脂質プロファイリング

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and abiotic stresses and also regulates water flow from the external environment.1 A biopolyester (cutin) and long-chain fatty acids (waxes) form the principal structural framework of the cuticle; the functional integrity of the cuticular layer depends on the outer 'epicuticular' layer as well as the blend consisting of the cutin biopolymer and 'intracuticular' waxes.2 Herein, we describe a comprehensive protocol to extract waxes exhaustively from commercial tomato (Solanum lycopersicum) fruit cuticles or to remove epicuticular and intracuticular waxes sequentially and selectively from the cuticle composite. The method of Jetter and Sch&auml;ffer (2001) was adapted for the stepwise extraction of epicuticular and intracuticular waxes from the fruit cuticle.3,4 To monitor the process of sequential wax removal, solid-state cross-polarization magic-angle-spinning (CPMAS) 13C NMR spectroscopy was used in parallel with atomic force microscopy (AFM), providing molecular-level structural profiles of the bulk materials complemented by information on the microscale topography and roughness of the cuticular surfaces. To evaluate the cross-linking capabilities of dewaxed cuticles from cultivated wild-type and single-gene mutant tomato fruits, MAS 13C NMR was used to compare the relative proportions of oxygenated aliphatic (CHO and CH2O) chemical moieties.
Exhaustive dewaxing by stepwise Soxhlet extraction with a panel of solvents of varying polarity provides an effective means to isolate wax moieties based on the hydrophobic characteristics of their aliphatic and aromatic constituents, while preserving the chemical structure of the cutin biopolyester. The mechanical extraction of epicuticular waxes and selective removal of intracuticular waxes, when monitored by complementary physical methodologies, provides an unprecedented means to investigate the cuticle assembly: this approach reveals the supramolecular organization and structural integration of various types of waxes, the architecture of the cutin-wax matrix, and the chemical composition of each constituent. In addition, solid-state 13C NMR reveals differences in the relative numbers of CHO and CH2O chemical moieties for wild-type and mutant red ripe tomato fruits. The NMR techniques offer exceptional tools to fingerprint the molecular structure of cuticular materials that are insoluble, amorphous, and chemically heterogeneous. As a noninvasive surface-selective imaging technique, AFM furnishes an effective and direct means to probe the structural organization of the cuticular assembly on the nm-&mu;m length scale.

Aerial plant organs are protected by the cuticle, a supramolecular biopolyester-wax assembly. We present protocols to monitor selective removal of epi- and intracuticular waxes from tomato fruit cuticles on molecular and micro scales by solid-state NMR and atomic force microscopy, respectively, and to assess the cross-linking capacity of engineered cuticular biopolyesters.

果実キューティクルの単離と生物物理学的研究

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they are believed to serve a central role in the adaptation and remodeling of the thylakoid membrane under rapidly changing environmental conditions. The capacity to isolate plastoglobules of high purity has greatly facilitated their study through proteomic, lipidomic, and other methodologies. With plastoglobules of high purity and yield, it is possible to investigate their lipid and protein composition, enzymatic activity, and protein topology, among other possible molecular characteristics. This article presents a rapid and effective protocol for the isolation of plastoglobules from chloroplasts of plant leaf tissue and presents methodological variations for the isolation of plastoglobules and related lipid droplet structures from maize leaves, the desiccated leaf tissue of the resurrection plant, Eragrostis nindensis, and the cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803. Isolation relies on the low density of these lipid-rich particles, which facilitates their purification by sucrose density flotation. This methodology will prove valuable in the study of plastoglobules from diverse species.

A fast and efficient protocol is presented for the isolation of plastoglobule lipid droplets associated with various photosynthetic organisms. The successful preparation of isolated plastoglobules is a crucial first step that precedes detailed molecular investigations such as proteomic and lipidomic analyses.

プラストグロビュール 植物葉組織およびシアノバクテリアからの脂肪滴分離

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...

植物キューティクル脂質ポリエステルモノマーの単離と組成分析

要約

さらに動画を探す

グラム陰性菌からの単離とリピドAの化学特性評価

超高性能液体クロマトグラフィーによる組成解析のための細菌細胞壁の分離と調製

植物のキューティクルの生合成を探検するシロイヌナズナeceriferum変異体の使用

爬虫類から皮膚脂質の分離、定量、化学分離

高 β-O-4 コンテンツによるリグニンの抽出軽度エタノール抽出と脱重合の収量に及ぼす影響

植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートI：リグニン

植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートII：炭水化物

気-液クロマトグラフィー（GLC）とあいまって薄層クロマトグラフィー（TLC）によりシロイヌナズナポーラーグリセロ脂質プロファイリング

果実キューティクルの単離と生物物理学的研究

プラストグロビュール植物葉組織およびシアノバクテリアからの脂肪滴分離

植物キューティクル脂質ポリエステルモノマーの単離と組成分析

要約

さらに動画を探す

グラム陰性菌からの単離とリピドAの化学特性評価

超高性能液体クロマトグラフィーによる組成解析のための細菌細胞壁の分離と調製

植物のキューティクルの生合成を探検するシロイヌナズナeceriferum変異体の使用

爬虫類から皮膚脂質の分離、定量、化学分離

高 β-O-4 コンテンツによるリグニンの抽出軽度エタノール抽出と脱重合の収量に及ぼす影響

植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートI：リグニン

植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートII：炭水化物

気-液クロマトグラフィー（GLC）とあいまって薄層クロマトグラフィー（TLC）によりシロイヌナズナポーラーグリセロ脂質プロファイリング

果実キューティクルの単離と生物物理学的研究

プラストグロビュール 植物葉組織およびシアノバクテリアからの脂肪滴分離

プラストグロビュール植物葉組織およびシアノバクテリアからの脂肪滴分離