The Rheumatology Research Foundation and the Hirschil Trust supported this work.

1.めっきCHO-ICAM細胞注：このステップの目標は、コンフルエントな単層を生成することを目標に一晩成長のためのフローチャンバーにCHO-ICAMの細胞をプレーすることです。 <ol><li> 37℃で10mlの％ウシ胎児血清（FBS）を補充したRPMI培地および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（CHO-ICAM完全培地）中で10cmの組織培養処理された培養皿にCHO-ICAM細胞を維持する5％ CO 2。 </li><li>細胞を収集するには、1ミリリットルの0.5％トリプシン-EDTAを追加し、穏やかに振盪しながら1分間室温でインキュベートします。メディアの4mlでトリプシンを中和します。 </li><li>血球計を用いてCHO-ICAM細胞をカウントし、室あたり0.75×10 5個の細胞を計算します。注：この実験では：2.25×10 5個の細胞が3室をシードするために必要とされます。 </li><li>遠心分離機0.75×10 500×gで5分間室あたり5 CHO-ICAM細胞、室温およびCHOの室あたり30μlの細胞ペレットを再懸濁-ICAM完全培養培地。 注：この実験では90μlを3室をシードするために必要とされます。 </li><li>ゆっくりとフローチャンバーの1リザーバ内にセルを追加。細胞は、5％CO 2で37℃インキュベーターで5分間沈降することを可能にします。 </li><li>各チャンバの2つのリザーバを横切って完全培養培地200μlのを追加します。システムが平衡するように、細胞の移動を避けるためには、2つの間の代替の追加。 </li><li> 5％CO 2で一晩37℃のインキュベーター内部の細胞をインキュベートします。 </li></ol> T細胞の調製注：このアッセイは、初代ヒトT細胞またはT細胞株を用いて行うことができます。血液からのT細胞の単離のプロトコールは、以前に記載されている。10、一次ヒトT細胞を使用する場合、最良の結果のために新鮮に単離された細胞を使用します。 T細胞株を使用する場合、セルのソースによって指定された培養プロトコルに従います。蛍光microscoの細胞を検出するためにT細胞をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）で標識されているPE。 <ol><li>血球計を使用したT細胞をカウントし、室あたり2×10 6個の細胞を計算します。注記：この実験では、6×10 6細胞を、3室のために必要とされるであろう。 </li><li>遠心分離機2×10 500×gで5分間の室あたり6 T細胞を、室温で、1％グルコースまたは2％FBSを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）1ml中の細胞を再懸濁します。 </li><li> 1でCFSEを追加：1,000希釈（5 mMのに行われた株式）。光から覆い、室温で8分間インキュベート</li><li> 5分、RTのために500×gでスピン。 </li><li> RPMI培地血清を欠くの条件あたり240μlの再懸濁細胞ペレット（第4章「注意」を参照してください）​​。この実験では、プレーンなRPMIの720μlの細胞ペレットを再懸濁します。各チャンバ、チューブあたり240μlのために標識空の1.5ミリリットルチューブに細胞を分割します。使用するまで37℃のヒートブロック中で細胞を保管してください。 </li></ol> 3.番目のセットアップ電子入力/出力ホースとシリンジポンプ<ol><li> 37°Cまでの顕微鏡ライブイメージング室を温めます。 </li><li> 入力ホースを準備します。 <ol><li>水と500ミリリットルのガラス瓶を記入し、蓋に2穴を作ります。 「中」とホールのラベルを付け、「アウト。」 これは、 入力メディアの加熱水浴として機能します。 </li><li>蓋の穴を通って水浴中にホースの入力を実行します。 &quot;アウト&quot;穴から来るシリンジに接続するホースの側が穴&quot;で&quot;と入力リザーバに接続する側を通って来ていることを確認してください。 </li><li>システムから空気を除去し、水60mlでホース入力を洗い流します。 </li><li>プライムRPMI培地は、血清を欠くとホースの入力は 37℃に温めました。 60ミリリットル注射器を記入し、ホースが完全にプライミングされた、任意の気泡を欠くするまでメディアを押し通します。 注：lengtに応じて、チューブの時間は異なりますプライムに必要なボリュームを使用していました。 <ol><li> （ここでは3）の実験でチャンバーの数により分（5分）の数で流れ（ここでは0.3 ml /分）の速度を乗算することにより、実験に必要なメディアの量を計算します。この実験では、4.5ミリリットルのメディアを使用しています。注：私たちは、プライミングした後、注射器に残っている（ここでは9.5ミリリットル合計）5ミリリットルに余分な容積を有するお勧めします。 </li></ol></li><li> 37℃を維持するために、顕微鏡のライブイメージングのエンクロージャに全体を入力セットアップを置きます。筐体の外にホースとシリンジを実行して、シリンジポンプにシリンジをロードします。 </li></ol></li><li> 出力ホースを準備します。 <ol><li> 出力廃棄物として使用するために250ミリリットルボトルの蓋に穴を作ります。 </li><li>穴を通ってボトルへ出力チューブを実行します。大まかにすべての方法を閉じていない、ふたを固定します。 </li><li>マイルのライブイメージングのエンクロージャに出力設定を置きますcroscope。 </li></ol></li><li>所望の剪断応力（ダイン/ cm 2で）を生成するために必要な流量（ml /分）を計算します。せん断応力はせん断​​応力レベルを決定する際に、したがって考慮細胞研究するタイプやトリートメントを含む全体的なモデルを取る、別の血管の区画で変化します。 注：これらの実験は、密接に小静脈設定を模倣する0.4ダイン/ cm 2で行われます。 <ol><li>せん断応力を計算する際に考慮室の寸法を取ります。フローチャンバーのために（メーカー11によって提供される）次の式を使用し（材料の表を参照してください）ここで使用される：T =η* 176.1 *øここで、T =せん断応力、η=動的粘度、O =流量。注：37℃でRPMI媒体の動的粘度は、0.007です。 </li></ol></li></ol>細胞のフローチェンバースと刺激の4読み込んでいます注：接着を開始するために、T細胞が刺激されなければなりません。以下の実験では、細胞が刺激されていないままにするか、またはSDF-1α12またはホルボールミリステートアセテート（PMA;陽性対照）で刺激されている13。 T細胞へのケモカインの適切なプレゼンテーションのために、CHO-ICAM細胞は、細胞表面上での提示を可能にする、（シリアル回洗浄した）SDF-1αと共にプレインキュベートされています。 PMAは、二次メッセンジャーのジアシルグリセロール（DAG）に構造的に類似しているホルボールエステルです。ここでは、陽性対照として使用します。 T細胞は、直前フローチャンバーにロードし、PMAで処理されます。 <ol><li>顕微鏡でのフローチャンバースライドを配置し、20Xの対物レンズを用いてCHO-ICAMの単層上で焦点面を設定します。 </li><li> 37℃のヒートブロック内の他のすべての条件をCFSEで染色したT細胞を保管してください。その条件のためのアッセイの直前に、次のようにCHO-ICAMまたはT細胞を準備します。 <ol><li>刺激されていない状態（チャンバ1）の場合、1チューブ/フローCHを保ちます未処理の琥珀は、刺激のための陰性対照として機能します。 </li><li> PMA刺激（チャンバ2）については、陽性対照として役立つようにPMA（10ng / ml）でT細胞の管を刺激します。フローチャンバーにロードする直前に扱います。 </li><li> SDF-1α刺激、（チャンバ3）の場合は、上部の貯水池（ 出力リザーバー ）から一度に3回を70μLを除去した後、自衛隊の70μLを加えることによって、SDF-1α（100ng / mlの）第3フローチャンバーを刺激します-1α（100ng / mlの）下池（ 入力リザーバ ）へ。 5分間インキュベートします。 </li></ol></li><li> 1室の出力リザーバーから3回を削除し、一度に70μLを捨てます。 </li><li> 3回入力リザーバに前処理された70μlの（該当する場合）のT細胞懸濁液を追加します。細胞は、チャンバ（「中」）の入口から移動できるように5分待ってから、チャンバーの近位出口（「アウト」）に達します。 </li><li>この間、画像5CFSE染色T細胞のためのフィールド。チャンバーの中央（ 図1）全体に分散されたフィールドを選択してください。励起レーザ波長：以下の励起/発光条件使用488nmでの、放射捕集フィルタ：500から540 nmの。これらの画像は、プレフロー細胞数となります。 </li><li>フローチャンバーの貯水池に同時に入力と出力のチューブを取り付けます。 注意：チャンバー内に気泡を導入し、チャンバ内の全体的な平衡を維持しないように同時にチューブを取り付けることが重要です。 </li><li> CFSE染色T細胞を可視化しながら、0.3ミリリットル/分（0.4ダイン/ cm 2）とで流れを開始します。フローは、特に第一のチャンバと、開始すると、したがって、T細胞の移動の開始タイミングで5分間の開始、多くの場合、流れを開始し、T細胞ローリングを観察する間に遅延が存在します。 </li><li> 5分後にフローを終了し、CFSEチャネル内の画像5フィールド。ランダムのthro分散フィールドを選択します。フローチャンバーの中心ughout（ 図1）。これらの画像は、後流の細胞数となります。 </li></ol> 5.接着細胞の割合の判定注：取得された画像中の細胞の数の決意を自動化ソフトウェアを使用して客観的に行われます。我々の研究のために我々は、そのようなImageJの（バージョン1.48V）などのソフトウェアVolocity（バージョン6.2.1）が、他のソフトウェアを使用するにも適用可能です。 <ol><li>各条件のためのフィールドプリフロー当たりの細胞数を決定します。 5フィールドの平均は「プレフロー平均細胞数」である。7 </li><li>各条件についてフィールドポストフロー当たりの細胞数を決定します。 5フィールドの平均は「ポストフローの平均細胞数」である。7 </li><li>以下の式を使用して接着細胞の割合を計算する： 接着細胞のパーセンテージ=（ポストフロー平均細胞数）/（プレフロー平均細胞数）×100％。 </li></ol>

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	<li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+on+the+run:+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells.">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).</li><li>Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. 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(88), (2014).</li><li>Ibidi GmbH. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+and+shear+rates+for+ibidi+&#956;-Slides+-+based+on+numerical+calculations.">Shear stress and shear rates for ibidi &#956;-Slides - based on numerical calculations.</a> Application Note 11. , (2014).</li><li>van Gijsel-Bonnello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pantethine+Alters+Lipid+Composition+and+Cholesterol+Content+of+Membrane+Rafts,+With+Down-Regulation+of+CXCL12-Induced+T+Cell+Migration.">Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration.</a> J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).</li><li>Tozeren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+of+adhesion+of+phorbol+12-myristate-13-acetate-stimulated+T+lymphocytes+to+planar+membranes+containing+intercellular+adhesion+molecule-1.">Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1.</a> Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).</li><li>Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+mechanisms+regulating+chemokine+activity+and+availability.">Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability.</a> Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).</li><li>Rot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+binding+assay+for+studying+chemokine+interactions+with+endothelial+cells.">In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells.</a> J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1+regulates+neutrophil+adhesion+and+transcellular+migration+of+TNF-alpha-activated+vascular+endothelium+under+flow.">ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow.</a> Blood. 106 (2), 584-592 (2005).</li><li>Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1:+getting+a+grip+on+leukocyte+adhesion.">ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion.</a> J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

正常T細胞の接着を分析するために、刺激は、インビトロの方法を選択する際に考慮しなければならない研究に含まれます。 LFA-1の活性化および結合ICAM-1につながる信号を研究するためのいくつかのアッセイがありますが、すべてのメソッドには互換性がありません。静的接着アッセイ10は、T細胞、APCの相互作用を研究するのに最適な、その代わりに、ここで詳述せん断応力法?...

Tリンパ球の接着は、T細胞輸送および抗原提示において重要な役割を果たし3、健康な免疫系に異なるプロセスの数を媒介します。免疫監視またはアクティブな免疫応答の間の接着のために、これらの二つの大きな役割が重要であるかどうか。4 T細胞-内皮細胞相互作用の生理学的なシグナル伝達イベントは、T細胞抗原提示細胞（APC）の相互作用とは区別されるため、別個の方法を必要と最高の関与するシグナル伝達カスケードを理解するための研究。リンパ球の血管外遊出中の血管壁へのT細胞の強固な接着を迅速かつ動的なインテグリン活性化を必要とします。内皮に沿って、アクティブ状態のインテグリンおよび接着分子間の緊密な相互作用は、T細胞は、細胞の通過に許容エリアの探索に表面に沿ってクロールすることができ、血液の流れに耐性の密着性につながる。5 T細胞の双方向のクロール-directionally ALONGA血管壁は、T細胞の異なる接着フロントエンドと、偏接着に頼るである。 図6は、最も重要なことは、強固な接着および遊出は、血流を循環させることにより生成される剪断力に対する抵抗を必要とします。 リンパ球の接着を研究するための実験を​​設計する場合、注意が興味のある特定の刺激に支払われるべきです。インテグリン活性化は、T細胞の接着のすべての形態の共通の重要な要素であるが、活性化のカスケードは、個々の受容体および共受容体の下流で一意である可能性があります。同様に、インテグリンおよび接着分子のペアは、特殊な微小環境で、特定の部分集団に機能します。このようにして、これらのペアは非常に異なって調節され得ます。ここで紹介するモデルは、せん断応力条件下で行わインテグリン活性化をもたらすシグナル伝達カスケードの研究のための理想的です。7これらの相互作用が十分に静的adhesiで理解することはできませんシステム上の衝撃によるこれらの力は、T細胞の挙動に直接有することが示されている。8のシステムは、T細胞およびヒトICAM-1（CHO-ICAM細胞）を発現するように操作されたCHO（チャイニーズハムスター卵巣）細胞をここにすることができる提示けれども簡単に異なる白血球集団または接着分子を研究するために改変することができます。 このアッセイは、白血球の血管外遊出の強固な接着段階のためのモデルを提供し、剪断応力を用いて、T細胞の接着およびインテグリンの活性化を定量化する方法を提供します。 CHO-ICAM細胞の使用を介して、生細胞中のそのリガンドに対するLFA-1の親和性は、目的の種々の刺激に応答してリアルタイムで調べることができます。この手法は、簡単に大きく、他のモデルと比較して、血流および剪断応力をモデル化するために必要な設備を簡素化、シリンジポンプと組み合わせた市販のマイクロ流チャンバを得る必要があります。9このアッセイの別の主要な利点は、特定のシグナリングでありますカスケードおよび個々のインテグリンの結果として生じる活性化状態は、きれいに、目的のヒトの接着分子を発現する操作されたCHO細胞を使用することによって研究することができます。さらに、生細胞イメージングで定量的データの組み合わせは、この方法の重要な利点です。静的なT細胞の接着のアッセイ数がうまくT細胞APCの相互作用をモデル化することが記載されているが全体として、これらのモデルは、T細胞、上皮細胞接着の動的なプロセスを取り込むには不十分です。接着アッセイを選択する際にこのような理由から、問題の刺激を考慮しなければなりません。

<table><tbody><tr><td>T cell samples (cell line or primary)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>Peripheral human T cells</td></tr><tr><td>CHO-ICAM-1 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2093</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;-Slide VI 0.4 ibiTreat</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td></td></tr><tr><td>500 ml glass bottle</td><td>Fisher</td><td>FB800500</td><td></td></tr><tr><td>250 ml glass bottle</td><td>Fisher</td><td>FB800250</td><td></td></tr><tr><td>Silicone tubing 0.8 mm</td><td>ibidi</td><td>10841</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope with incubator chamber</td><td>Ziess</td><td>700</td><td>Any wide field fluorescent microscope</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>60 ml syringe</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>eBioscience</td><td>65-0850</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1&amp;alpha;</td><td>R&amp;amp;D</td><td>350-NS-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>12-702F/12</td><td></td></tr><tr><td>PBS&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16561-29-8</td><td></td></tr><tr><td>Volocity software</td><td>Perkin Elmer</td><td>Version 6.2.1</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td>Version 1.48V</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-culture treated culture dishes</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red</td><td>Gibco</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>Heat Inactivated FBS</td><td>Denville</td><td>FB5001-H</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Fisher</td><td>BP295950</td><td></td></tr></tbody></table>

assay of adhesion under shear stress for the study of t lymphocyte-adhesion molecule interactions

全体的に、T細胞の接着は、免疫学的シナプスの形成における抗原提示細胞（APC）と炎症との相互作用の部位への細胞漸増の明確なプロセスに貢献し、機能の重要なコンポーネントです。 T細胞の接着のこれら二つのコンテキストは、T細胞 - 血管相互作用が循環自体によって生じるせん断応力によりチャレンジされている間の相互作用は、静的と考えることができるT細胞APCが異なります。 2つの細胞パートナーが互いに静的な相対的であるという点で、T細胞APCの相互作用は、静的に分類されます。通常、この相互作用は、リンパ節内で発生します。 T細胞は、血管壁と相互作用するように、細胞が停止し、生成された剪断応力に耐えなければならない。1,2-これらの違いは、より優れた二つの別個の調節プロセスとして流動条件下での静的接着性及び密着性を理解する必要性を強調しています。 T細胞の接着の調節は、最も簡潔に詐欺のように記述することができます細胞表面上に発現される分子をインテグリン、それによって相互作用する細胞の表面に発現接着分子リガンドとインテグリンとの相互作用を調節する親和性状態をトローリング。インテグリン親和性状態の規制の我々の現在の理解は、in vitroモデル系において 、多くの場合、単純化から来ています。ここで説明したフロー条件を使用して接着のアッセイは、刺激に続くリアルタイムでT細胞、上皮細胞間相互作用の可視化と正確な定量を可能にします。フローアッセイの下の密着性が阻害または刺激性物質で処理した後のT細胞内のシグナル伝達接着の研究にも適用することができます。さらに、このアッセイは、任意の接着白血球集団および任意のインテグリン接着分子対にT細胞シグナル伝達を超えて拡張することができます。

代表的な結果は、Jurkat細胞および初代ヒトCD3 + T細胞を用いたフロー接着アッセイで示され、示されているように、SDF-1αで刺激しました。すべて示される実験における負の対照は、刺激されていない細胞です。非刺激細胞の閾値基礎パーセント接着は、5との間にある - 10％。特に、この範囲を超える塩基の密着性が問題と実験を示し、T細胞の開始集団は非特?...

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Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

この流接着アッセイは、T細胞、上皮細胞間相互作用の単純な、耐衝撃性モデルを提供します。シリンジポンプは、剪断応力を生成するために使用し、共焦点顕微鏡は、定量化のための画像を捕捉します。これらの研究の目的は、効果的に流れ条件を使用して、T細胞接着を定量化することです。

Tリンパ球接着分子の相互作用の研究のための接着性の下でせん断応力の測定

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.4K ビュー.  New York University School of Medicine. この流接着アッセイは、T細胞、上皮細胞間相互作用の単純な、耐衝撃性モデルを提供します。シリンジポンプは、剪断応力を生成するために使用し、共焦点顕微鏡は、定量化のための画像を捕捉します。これらの研究の目的は、効果的に流れ条件を使用して、T細胞接着を定量化することです。 

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Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

用接着周波数アッセイその場で</em細胞間のインタフェースにおけるクロス接合分子間相互作用の>速度論解析

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

生物工学

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

細菌付着の研究ではせん断応力を導入する

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

免疫・感染学

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the homeostasis of adult tissues. Interestingly, oxidative stress can alter these processes, thus contributing to the pathophysiology of diseases such as metastatic cancer. Therefore, understanding the mechanism(s) of how cells attach and spread on the ECM during perturbations in redox status can provide insight into normal and disease states. Described below is a step-wise protocol that utilizes an immunofluorescence-based assay to specifically quantify cell adhesion and spreading of immortalized fibroblast cells on fibronectin (FN) in vitro. Briefly, anchorage-dependent cells are held in suspension and exposed to the ATM kinase inhibitor Ku55933 to induce oxidative stress. Cells are then plated on FN-coated surface and allowed to attach for predetermined periods of time. Cells that remain attached are fixed and labeled with fluorescence-based antibody markers of adhesion (e.g., paxillin) and spreading (e.g., F-actin). Data acquisition and analysis are performed using commonly available laboratory equipment, including an epifluorescence microscope and freely available Fiji software. This procedure is highly versatile and can be modified for a variety of cell lines, ECM proteins, or inhibitors in order to examine a broad range of biological questions.

This method is useful for quantifying the early dynamics of cellular adhesion and spreading of anchorage-dependent cells onto the fibronectin. Furthermore, this assay can be used to investigate the effects of altered redox homeostasis on cell spreading and/or cell adhesion-related intracellular signaling pathways.

酸化ストレス中のフィブロネクチン上皮細胞の細胞接着と広がりのダイナミクスを調べる

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

生化学

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

せん断応力のヒト肝類洞内皮条件のことを白血球の募集を研究するフロー接着アッセイ

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Tリンパ球におけるインテグリン活性化の研究のための静的な接着アッセイ

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

炎症性腸疾患における癒着防止治療の機能分析のための動的接着アッセイ

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

内皮細胞接着性の定量<em&gt;インビトロ</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

生物学

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

磁気ビーズを使用した機械的張力に応答して細胞表面接着リフォームの分析

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like pressure or mechanical perturbations. Mechanoreceptors detect their stimuli and transmit signals via a great diversity of mechanisms. Some of the most common roles for mechanoreceptors are in neuronal responses, like touch and pain, or hair cells which function in balance and hearing. Mechanosensation is also important for cell types which are regularly exposed to shear stress such as endothelial cells, which line blood vessels, or blood cells which experience shear in normal circulation. Viscometers are devices that detect the viscosity of fluids. Rotational viscometers may also be used to apply a known shear force to fluids. The ability of these instruments to introduce uniform shear to fluids has been exploited to study many biological fluids including blood and plasma. Viscometry may also be used to apply shear to the cells in a solution, and to test the effects of shear on specific ligand-receptor pairs. Here, we utilize cone-plate viscometry to test the effects of endogenous levels of shear stress on platelets treated with antibodies against the platelet mechanosensory receptor complex GPIb-IX.

We describe an in-solution method to apply uniform shear to platelet surface receptors using cone-plate viscometry. This method may also be used more broadly to apply shear to other cell types and cell-fragments and need not target a specific ligand-receptor pair.

コーンプレート Viscometry を介したヒト血小板および細胞表面レセプターに対する均一なせん断アッセイ

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like ...

Tリンパ球接着分子の相互作用の研究のための接着性の下でせん断応力の測定

要約

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