The Rheumatology Research Foundation and the Hirschil Trust supported this work.

1. 도금 CHO-ICAM 세포 주 :이 단계의 목적은 합류 단층을 생성하는 것을 목표로 밤새 성장 유동 챔버의 CHO-ICAM 세포 플레이트이다. <ol><li> 5 %, 37 ℃에서 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (CHO-ICAM 완전 배지)로 보충 된 10 ml의 RPMI 배지에서 10cm 조직 배양 처리 된 배양 접시에서 CHO-ICAM 세포 유지 CO 2. </li><li> 세포를 수집하기 위해, 1 ml의 0.5 % 트립신 EDTA를 추가하고 온화한 진탕 1 분 동안 실온에서 배양한다. 미디어의 4 ml의 트립신을 중화. </li><li> hemacytometer를 사용하여 CHO-ICAM 세포를 계산하고 챔버 당 0.75 × 10 5 세포를 계산합니다. 참고 :이 실험에서 : 2.25 × 10 5 세포 3 실 시드 필요합니다. </li><li> 원심 0.75 × 105 CHO-ICAM의 500 XG, 실온에서 5 분 동안 실 당 세포 및 CHO의 챔버 당 30 μL의 세포 펠렛을 재현 탁-ICAM 전체 문화 미디어. 참고 :이 실험에서는 90 μl의 3 챔버 시드 필요합니다. </li><li> 천천히 유량 용기의 한 저수지로 세포를 추가합니다. 세포가 5 % CO 2와 37 °의 C 배양기에서 5 분 동안 정착하도록 허용합니다. </li><li> 각 실의 두 저수지에 걸쳐 완전한 배양 배지 200 μl를 추가합니다. 시스템이 평형화 같이 둘 사이의 추가는 다른 세포의 이동을 방지한다. </li><li> 5 % CO 2와 37 °의 C 배양기 내에서 하룻밤 세포를 품어. </li></ol> T 세포의 제조 2 주 :이 분석은 일차 인간 T 세포 또는 T 세포 라인으로 수행 될 수있다. 혈액 T 세포의 분리에 대한 프로토콜은 이전에 설명되었다.하여 10 일차 인간 T 세포가 최상의 결과를 새롭게 분리 된 세포를 사용하는 경우. T 세포 라인을 사용하는 경우, 셀의 소스에 의해 지정된 배양 프로토콜을 따른다. 형광 microsco에 세포를 검출하기 위해T 세포가 카복시 플루오 레세 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE)로 표시되어 퍼가기. <ol><li> hemacytometer를 이용하여 T 세포를 세어 챔버 당 2 × 106 개 세포를 계산한다. 주 :이 실험에서는 6 × 106 세포를 3 챔버에 대해 필요하다. </li><li> 원심 분리 (2)는 T × 106 500 × g으로 실온에서 5 분 동안 세포 챔버 당 1 % 글루코스 또는 2 % FBS를 함유하는 인산염 완충 생리 식염수 1 ㎖의 세포 (PBS)에 재현 탁. </li><li> 1 CFSE 추가 : 1000 희석 (주 5 mm로했다). 빛 덮고 실온에서 8 분 동안 품어 </li><li> 5 분, RT 500 XG에 스핀. </li><li> 조건 당 240 μL에 재현 탁 세포 펠렛을 RPMI 미디어 부족 혈청 (4 절 &quot;주의&quot;를 참조하십시오). 이 실험에서는, 일반 RPMI 720 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁. 각 챔버, 튜브 당 240 ㎕의 표지 빈 1.5 ml의 튜브에 세포를 나눈다. 사용할 때까지 37 ° C 열 블록의 세포를 유지합니다. </li></ol> 3 일 설정전자 입력 / 출력 뿌리고과 주사기 펌프 <ol><li> 37 ° C에 현미경 라이브 영상 실을 따뜻하게. </li><li> 입력 뿌리고을 준비합니다 : <ol><li> 물 500㎖의 유리 병을 채우고 뚜껑으로이 구멍을 만든다. 그리고 &quot;의&quot;구멍 레이블을 &quot;알아.&quot; 이 입력 매체 가열 수조로서 작용한다. </li><li> 뚜껑과 수조 내로 관통 뿌리기 입력을 실행. &quot;출력&quot;구멍을 통해 제공되는 주사기에 연결 뿌리고의 측면 구멍 &quot;에서&quot;, 입력 저수지에 연결 측면을 통해 오는 있는지 확인합니다. </li><li> 시스템에서 모든 공기를 제거하기 위해 물 60 ㎖로 뿌리기 입력을 플래시합니다. </li><li> 프라임 RPMI 미디어 혈청 부족으로 뿌리기 입력은 37 ° C로 예열. 60 ML의 주사기를 입력하고 뿌리고 완전히 끝났다과 공기 방울을 결여 될 때까지 미디어를 통해 밀어 넣습니다. 참고 : lengt 기반으로 주사기 Z- 추적 injection.Size에 따라튜브의 시간은 달라질 수 소수에 필요한 볼륨을 사용했다. <ol><li> (여기서 3) 실험 챔버의 수에 의해 분 (5 분)의 개수에 의해 흐름 (여기에서는 0.3 ㎖ / 분)의 속도를 곱함으로써 실험에 필요한 매체의 부피를 계산하게하고; 이 실험에서, 4.5 ml의 용지를 사용합니다. 참고 : 우리는 프라이밍 후 주사기에 남아있는 (여기에 9.5 ㎖의 총) 5 ml의 여분의 체적을 갖는 것이 좋습니다. </li></ol></li><li> 37 ° C를 유지하기 위해 현미경의 라이브 영상 인클로저에 전체 입력 설정을 놓습니다. 뿌리고을 실행하고 인클로저 밖으로 주사기와 주사기 펌프에 주사기를로드합니다. </li></ol></li><li> 출력 뿌리고을 준비합니다 : <ol><li> 출력 폐기물로 사용하는 250 ml의 병의 뚜껑에 구멍을 만듭니다. </li><li> 구멍을 통해 병에 출력 튜브를 실행합니다. 느슨하게 뚜껑을 고정하는 모든 방법을 폐쇄하지. </li><li> 마일의 라이브 영상 인클로저로 출력 설정을 배치croscope. </li></ol></li><li> 원하는 전단 응력 (DYN / cm 2)을 생성하기 위해 상기 유량 (ml / 분)에 필요한 계산. 전단 응력 따라서 계정으로 세포 연구 할 유형과 치료 전단 스트레스 수준 결정을 포함하여 전체 모델을, 다른 혈관 구획에 따라 다릅니다. 참고 :이 실험은 밀접하게 작은 정맥 설정을 모방하기 위해 0.4 DYN / cm 2에서 수행된다. <ol><li> 전단 응력을 계산할 때 고려 챔버의 크기를 가져 가라. 여기에 사용 된 흐름 챔버 용 (제조업 (11)에 의해 제공) 다음 공식을 사용 (재료의 표 참조) : T = η * 176.1 *의 ø는 T = 전단 응력, η = 동적 점도, ø는 = 유량 곳. 참고 : 37 ° C에서 RPMI 미디어의 동적 점도는 0.007이다. </li></ol></li></ol> 셀 흐름 챔버와 자극 4.로드 주 : 접착을 개시하기 위해,T 세포를 자극한다. 다음 실험에서 세포를 자극되지 남아 있거나 SDF-1α (12) 또는 포르 볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA, 양성 대조군)으로 자극 13. T 세포에 대한 케모카인의 적절한 프리젠 테이션을 위해, CHO-ICAM 세포는 세포 표면에 프레 수 (연속 세척 하였다) SDF-1α와 함께 예비 인큐베이션한다. PMA는 제 톡 디아 실 글리세롤 (DAG)와 구조적으로 유사한 포르 볼 에스테르; 여기로는 양성 대조군으로 사용된다. T 세포는 바로 전에 유동 챔버 내로 로딩하기 PMA로 처리된다. <ol><li> 현미경의 흐름 챔버 슬라이드를 놓고 20 배 목표를 사용하여 CHO-ICAM 단층에 초점면을 설정합니다. </li><li> 37 ° C 열 블록에있는 다른 모든 조건 CFSE - 스테인드 T 세포를 유지합니다. 그 조건에 대한 분석 직전에 다음과 같이 CHO-ICAM 또는 T 세포를 준비합니다 <ol><li> 비자극 조건 (챔버 (1))의 경우, 하나의 튜브 / 유동 채널을 유지치료 황색, 자극에 대한 부정적인 제어를 제공합니다. </li><li> PMA 자극 (챔버 (2))의 경우, 양성 대조군으로서 역할하는 PMA (10 NG / ㎖)와 T 세포를 자극 한 튜브; 유량 용기에 넣기 전에 즉시 처리합니다. </li><li> SDF-1α 자극 (챔버 (3))의 경우, 상부 리저버 (출력 저장조)에서 한 번에 3 회 70 μL를 제거하고 SDF의 70 μl를 첨가하여 SDF-1α (100 NG / ㎖)와 제 3 유동 챔버를 자극 -1α (100 NG / ㎖) 하부 통 (입력 저수지)로. 5 분 동안 품어. </li></ol></li><li> 하나의 챔버의 출력 저장소로부터 3 회 제거하고 시간에 70 μl를 버린다. </li><li> 입력 저수지로 3 회를 전처리 (해당되는 경우) T 세포 현탁액의 70 μl를 추가합니다. 세포가 챔버 ( &quot;에서&quot;)의 입구에서 이동할 수 있도록하기 위해 5 분을 기다린 챔버의 근위 출구 ( &quot;아웃&quot;)에 도달 할 수 있습니다. </li><li> 이 시간 동안, 화상 (5)CFSE - 스테인드 T 세포에 대한 필드. 챔버 (그림 1)의 중심에 걸쳐 분산되어있는 필드를 선택합니다. 여기 레이저 파장 : 다음 여기 / 방출 488 nm의 조건으로 사용하는 단계; 발광 컬렉션 필터 : 500-540 나노. 이러한 이미지는 미리 유동 세포 수의 역할을한다. </li><li> 유량 용기 저수지에 동시에 입력 및 출력 튜브를 연결합니다. 주 : 챔버 내에 기포를 도입하여 챔버 내의 전체적인 균형을 유지하지 않도록 동시에 튜브를 부착하는 것은 매우 중요하다. </li><li> CFSE - 스테인드 T 세포를 시각화하는 동안 0.3 ml / 분 (0.4 DYN / cm 2)에서 흐름을 시작합니다. 흐름은, 특히 제 1 챔버와, 시작으로, 따라서 T 세포 이동의 개시 타이밍에서 5 분 시작 종종 유동을 시작 및 T 세포를 관찰 압연의 차이도있다. </li><li> 5 분 후, 흐름을 종료하고 CFSE 채널에서 이미지 필드 5. 무작위로 죽 분산 필드를 선택유동 챔버의 중심 ughout (도 1). 이러한 이미지는 이후 흐름 세포 수의 역할을 할 것이다. </li></ol> 5. 접착 세포의 비율을 결정 주 : 획득 된 영상에서 세포 수의 측정은 자동 소프트웨어 객관적으로 이루어진다. 우리의 연구에 우리는 ImageJ에 (버전 1.48V)와 같은 소프트웨어 Volocity (버전 6.2.1)하지만 다른 소프트웨어를 사용하여도 적용 할 수있다. <ol><li> 각 조건에 대한 필드 사전 흐름 당 세포의 수를 결정합니다. 5 필드의 평균은 &quot;프리 플로우 평균 세포 수&quot;입니다. (7) </li><li> 각 조건에 대한 필드 이후의 흐름에 따라 세포의 수를 결정합니다. 5 필드의 평균은 &quot;포스트 흐름 평균 세포 수&quot;입니다. (7) </li><li> 다음 수식을 사용하여 부착 된 세포의 비율을 계산 / (프리 플로우 평균 세포 수) = 부착 세포 (포스트 플로우 평균 세포 수)의 비율 × 100 %. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

올바르게 T 세포 유착을 분석하기 위하여, 자극은 시험관 내 방법을 선택할 때 고려되어야 연구에 포함된다. LFA-1의 활성화 및 바인딩 ICAM-1에 이르는 신호를 연구하는 여러 가지 분석이 있지만 모든 방법이 서로 호환되지 않습니다. 정적 접착 분석 (10)는 최적의 T 세포 APC의 상호 작용을 연구하는 데 적합하다; 대안으로, 여기에 설명 된 전단 응력 방법은 T 세포 상피 세포의 상호 작?...

T 림프구 접착 성 T 세포 트래 피킹 및 항원 제시에 중요한 역할을 수행하는 3 건강한 면역 시스템의 고유 프로세스들을 중재한다. 면역 감시 또는 접착이 두 가지 역할이 중요한 활성 면역 반응 동안의 여부. 4 T 세포 - 내피 세포 상호 작용의 생리 학적 신호 이벤트 (APC) 상호 셀 제시 T 세포 항원을 구별하고, 따라서의 구분 방법을 필요 연구는 가장 관련된 신호 폭포를 이해합니다. 림프구 넘쳐 중에 혈관 벽에 대한 T 세포의 밀착성 신속한 동적 인테그린 활성화를 필요로한다. 내피 따라 액티브 상태 인테그린 접착 분자 간의 긴밀한 상호 작용은 T 세포가 세포 통로 허용 영역 검색에 표면을 따라 기어 있도록 혈류에 강한 접착력을 이끈다. 5 T 세포의 Bi 크롤링 -directionally 아론GA 혈관벽은 T 세포의 구별 접착제 선단부와 편광 접착시에 의존한다.도 6은 가장 중요한 것은, 밀착성 및 윤회 혈류 순환에 의해 발생되는 전단력에 대한 저항을 요구한다. 림프구 접착력을 연구하는 실험을 설계 할 때,주의가 관심있는 특정 자극에 지불해야한다. 인테그린 활성화하는 T 세포 유착 모든 형태의 일반적이고 중요한 요소이지만, 활성화 캐스케이드의 개별 수용체 공동 수용체의 하류 고유 할 가능성이있다. 마찬가지로, 인테그린 및 접착 분자 쌍은 전문 미세 환경에서 특정 소집단에 작동합니다. 이와 같이, 이러한 쌍은 매우 다르게 조절 될 수있다. 여기에 제시된 모델은 전단 응력 조건에서 발생하는 활성화를 인테그린에 이르는 폭포 신호의 연구에 이상적입니다. (7) 이러한 상호 작용이 적절히 정적 adhesi에서 이해 될 수 없다시스템에 의한 충격이 힘은 8 비록. T 세포의 행동을 직접 갖고 도시 한 인간 ICAM-1 (CHO-ICAM 세포)를 발현하도록 유전자 조작 된 T 세포 및 CHO (중국 햄스터 난소) 세포 시스템을 수 여기서 제시 쉽게 백혈구 집단 또는 다른 부착 분자 연구를 수정할. 이 분석은, 백혈구의 혈관 외 유출의 밀착성 스테이지에 대한 모델을 제공하고, 전단 응력을 이용하여 T 세포의 접착 성 및 인테그린 활성화를 정량하는 방법을 제공한다. CHO-ICAM 세포를 이용하여 살아있는 세포에서의 리간드 LFA-1의 친화 관심 다양한 자극에 응답하여 실시간으로 검사 할 수있다. 이러한 기술은 용이하게 크게 다른 모델에 비해 혈류 및 전단 응력을 모델링하는 데 필요한 장비를 단순화 주사기 펌프를 조합하여 시판 미세 유동 챔버를 얻을 필요. (9) 상기 분석의 다른 주요 장점은 특정 시그널링 있다는캐스케이드 개별 인테그린의 결과 활성화 상태는 깨끗하게 관심 인간 부착 분자를 발현하는 CHO 세포 공학을 사용하여 조사 할 수있다. 또한, 생균 이미징 정량적 데이터의 조합이 방법의 중요한 장점이다. 정적 T 세포 부착 분석법 다수 좋게 T 세포 APC 상호 작용을 모델링하는 설명되었지만 전반적으로,이 모델은 T 세포의 상피 부착 동적 프로세스 포착이 불충분하다. 접착 시험을 선택할 때이 때문에, 당해 자극을 고려해야한다.

<table><tbody><tr><td>T cell samples (cell line or primary)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>Peripheral human T cells</td></tr><tr><td>CHO-ICAM-1 cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2093</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;-Slide VI 0.4 ibiTreat</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td></td></tr><tr><td>500 ml glass bottle</td><td>Fisher</td><td>FB800500</td><td></td></tr><tr><td>250 ml glass bottle</td><td>Fisher</td><td>FB800250</td><td></td></tr><tr><td>Silicone tubing 0.8 mm</td><td>ibidi</td><td>10841</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope with incubator chamber</td><td>Ziess</td><td>700</td><td>Any wide field fluorescent microscope</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>60 ml syringe</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>eBioscience</td><td>65-0850</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1&amp;alpha;</td><td>R&amp;amp;D</td><td>350-NS-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>12-702F/12</td><td></td></tr><tr><td>PBS&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16561-29-8</td><td></td></tr><tr><td>Volocity software</td><td>Perkin Elmer</td><td>Version 6.2.1</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td>Version 1.48V</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-culture treated culture dishes</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red</td><td>Gibco</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>Heat Inactivated FBS</td><td>Denville</td><td>FB5001-H</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Fisher</td><td>BP295950</td><td></td></tr></tbody></table>

assay of adhesion under shear stress for the study of t lymphocyte-adhesion molecule interactions

전반적으로, T 세포 유착, 면역 시냅스 형성 항원 제시 세포 (APC)와 상호 작용 및 염증 부위로 세포 모집 고유 프로세스에 기여 함수의 중요한 구성 요소이다. T 세포의 혈관 작용은 순환 자체에 의해 발생되는 전단 응력에 의해 도전하는 동안 T 세포 유착이 두 상황은 휴대 APC 상호 정적으로 간주 될 수있는 T 다르다. T 세포 APC 상호 작용은 두 개의 휴대 파트너가 서로 정적 상대적 점에서 정적으로 분류하고 있습니다. 일반적으로, 이러한 상호 작용이 임파절 내에서 발생한다. T 세포가 혈관의 벽과 상호 작용으로 세포를 구속하고 생성 된 전단 응력에 저항해야한다. -1,2- 이러한 차이는 더 두 가지 규정하는 처리와 유동 조건에서 고정 부착 및 접착 성 증진의 필요성을 강조. T 세포 접착의 조절이 가장 간결 단점이라고 할 수있다세포 표면에 발현 분자 인테그린과 상호 작용하여 세포의 표면에 발현되는 접착 분자 인테그린 리간드의 상호 작용을 조절하는 친 화성 상태 조업. 인테그린 선호도 상태의 규제의 우리의 현재 이해는 체외 모델 시스템에서 종종 단순한에서 온다. 접착 여기서 설명 유동 조건을 사용하여 분석하고 시각화 자극 다음 실시간 T 세포 상피 세포 상호 작용의 정확한 정량을 허용한다. 유동 검정 하에서 접착 저해 또는 자극 물질로 처리 다음 T 세포 내 시그널링 밀착성 시험에 적용될 수있다. 또한,이 분석은 접착제 백혈구 집단 및 인테그린 접착 분자 쌍 T 세포 신호 전달을 넘어 확장 될 수있다.

나타낸 바와 같이, 대표적인 결과 SDF-1α 자극, 주르 케트 일차 인간 CD3 + T 세포를 사용하여 유동 부착 분석법에서 도시된다. 모든 도시 실험에서 음성 대조군은 무 자극 세포이다. 자극되지 않은 셀의 문턱 기저 %의 밀착성 5 사이 - 10 %; 특히이 범위에서 상기 기재의 밀착성이 문제가 실​​험을 나타내고 T 세포의 시작 인구 비특이적 제제에 미리 활성화 하였다 나?...

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Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

이 플로우 접착 분석은 T 세포 상피 세포 상호 작용의 간단한 고 충격 모델을 제공한다. 주사기 펌프는 전단 응력을 생성하기 위해 사용하고, 공 초점 현미경 정량 이미지를 캡처한다. 이 연구의 목적은 효과적으로 유동 조건을 이용하여 T 세포 유착을 정량화하는 것이다.

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.4K 조회수.  New York University School of Medicine.  이 플로우 접착 분석은 T 세포 상피 세포 상호 작용의 간단한 고 충격 모델을 제공한다. 주사기 펌프는 전단 응력을 생성하기 위해 사용하고, 공 초점 현미경 정량 이미지를 캡처한다. 이 연구의 목적은 효과적으로 유동 조건을 이용하여 T 세포 유착을 정량화하는 것이다. 

비디오: Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서</em셀 - 셀 인터페이스에서 교차 Junctional 분자의 상호 작용> 속도론 해석

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

연구

생체공학

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

면역학 및 감염병학

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the homeostasis of adult tissues. Interestingly, oxidative stress can alter these processes, thus contributing to the pathophysiology of diseases such as metastatic cancer. Therefore, understanding the mechanism(s) of how cells attach and spread on the ECM during perturbations in redox status can provide insight into normal and disease states. Described below is a step-wise protocol that utilizes an immunofluorescence-based assay to specifically quantify cell adhesion and spreading of immortalized fibroblast cells on fibronectin (FN) in vitro. Briefly, anchorage-dependent cells are held in suspension and exposed to the ATM kinase inhibitor Ku55933 to induce oxidative stress. Cells are then plated on FN-coated surface and allowed to attach for predetermined periods of time. Cells that remain attached are fixed and labeled with fluorescence-based antibody markers of adhesion (e.g., paxillin) and spreading (e.g., F-actin). Data acquisition and analysis are performed using commonly available laboratory equipment, including an epifluorescence microscope and freely available Fiji software. This procedure is highly versatile and can be modified for a variety of cell lines, ECM proteins, or inhibitors in order to examine a broad range of biological questions.

This method is useful for quantifying the early dynamics of cellular adhesion and spreading of anchorage-dependent cells onto the fibronectin. Furthermore, this assay can be used to investigate the effects of altered redox homeostasis on cell spreading and/or cell adhesion-related intracellular signaling pathways.

세포 부착의 역학 을 검사 하 고 산화 스트레스 동안 Fibronectin에 상피 세포의 확산

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

생화학

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

T 림프구에있는 인테그린 활성화의 연구에 대한 정적 접착 분석

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

내피 세포 접착 정량<em&gt; 체외</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

생물학

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both force-sensing molecules at adhesion sites, and force-dependent transcription factors that regulate lineage-specific gene expression and drive phenotypic outputs. However, the signaling networks converting mechanical tension into biochemical pathways have remained elusive. To explore the signaling pathways engaged upon mechanical tension applied to cell surface receptor, superparamagnetic microbeads can be used. Here we present a protocol for using magnetic beads to apply forces to cell surface adhesion proteins. Using this approach, it is possible to investigate not only force-dependent cytoplasmic signaling pathways by various biochemical approaches, but also adhesion remodeling by magnetic isolation of adhesion complexes attached to the ligand-coated beads. This protocol includes the preparation of ligand-coated superparamagnetic beads, and the application of define tensile forces followed by biochemical analyses. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating that tension applied to integrin-based adhesion triggers adhesion remodeling and alters protein tyrosine phosphorylation.

Cell surface adhesions are central in mechanotransduction, as they transmit mechanical tension and initiate the signaling pathways involved in tissue homeostasis and development. Here, we present a protocol for dissecting the biochemical pathways that are activated in response to tension, using ligand-coated magnetic microbeads and force application to adhesion receptors.

자석 구슬을 사용하여 기계 인장에 대한 응답으로 세포 표면 접착 리모델링 분석

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like pressure or mechanical perturbations. Mechanoreceptors detect their stimuli and transmit signals via a great diversity of mechanisms. Some of the most common roles for mechanoreceptors are in neuronal responses, like touch and pain, or hair cells which function in balance and hearing. Mechanosensation is also important for cell types which are regularly exposed to shear stress such as endothelial cells, which line blood vessels, or blood cells which experience shear in normal circulation. Viscometers are devices that detect the viscosity of fluids. Rotational viscometers may also be used to apply a known shear force to fluids. The ability of these instruments to introduce uniform shear to fluids has been exploited to study many biological fluids including blood and plasma. Viscometry may also be used to apply shear to the cells in a solution, and to test the effects of shear on specific ligand-receptor pairs. Here, we utilize cone-plate viscometry to test the effects of endogenous levels of shear stress on platelets treated with antibodies against the platelet mechanosensory receptor complex GPIb-IX.

We describe an in-solution method to apply uniform shear to platelet surface receptors using cone-plate viscometry. This method may also be used more broadly to apply shear to other cell types and cell-fragments and need not target a specific ligand-receptor pair.

원뿔형 플레이트 점도를 통한 인간 혈소판 및 세포 표면 수용 체에 대 한 균일 한 전단 분석

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like ...

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

요약

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에 대한 접착 주파수 분석 현장에서 속도론 해석