この方法により、研究者は、酸化ストレス時に細胞外マトリックスタンパク質フィブロネクチンへの細胞接着および細胞外マトリックスタンパク質への広がりの初期のダイナミクスを定量化することができます。この技術は多目的であり、広範囲の条件下で細胞骨格動態を調べるために適合させることができる。また、データ取得と解析は、一般的な実験機器や自由に利用できるソフトウェアを使用して行われます。
レドックス状態の変化の間に細胞がECMに付着し、広がるメカニズムを理解することは、転移癌のような正常および疾患状態に関する貴重な洞察を提供することができる。この方法は、さまざまな細胞培養条件下での細胞の広がりと接着、アンカレッジ依存性細胞株、および/酸化剤を調べて、幅広い生物学的問題に答えるために使用できます。この技術を実行するために必要な試薬は数多くあります。
したがって、すべてのソリューションは、開始する前に事前に行われていることが不可欠です。BSL-II認定層流フードでは、組織培養認定の24ウェルプレートをセットしました。各ウェルに1つのガラスカバースリップを入れます。
テキストプロトコルの図1Bに従ってプレートにラベルを付けます。次に、フィブロネクチン溶液のピペット500マイクロリットルを各ウェルに入れ。各カバースリップの上に溶液を数回ピペットし、均一なコーティングと完全な水没を保証します。
蓋でプレートを覆います。5%の二酸化炭素で37°Cでプレートを1時間インキュベートします。次に、インキュベーターからプレートを取り出し、フィブロネクチン溶液をウェルから吸引する。
1回の1X PBSの500マイクロリットルを使用してウェルを3回洗浄します。1X PBSの最終洗浄を吸引し、5%の炭酸ガスを最低15分間、摂氏37度で500マイクロリットルの0.5%脱脂BSA溶液でブロックします。まず、摂氏37度の水浴で必要な溶液を事前に温めます。
BSL-II認定層流フードでは、10平方センチメートルの皿のREF52細胞のコンフルエント単層から始め、暖かい1X PBSの6ミリリットルで細胞を2回洗います。血清は、6ミリリットルの温かい脱脂BSA溶液中で少なくとも1時間細胞を飢えさせる。次に、温めた1X PBSの6ミリリットルで細胞を洗います。
PBSを吸引し、1.5ミリリットルの温かい0.5%トリプシン-EDTA溶液を加えます。約2分間、5%の二酸化炭素で37°Cで細胞をインキュベートします。取り外しが完了したことを確認するために、軽い顕微鏡の下で細胞を観察してください。
ベンチ上部のプレートをタップした後も細胞が接着している場合は、さらに2分間インキュベーターに戻します。ピペット1.5ミリリットルの温かいトリプシン中和溶液、TNSは、トリプシン化を停止し、切り離された細胞を収集する皿に。溶液をプレートの底面を何度も上下にピペットし、残りの接着細胞をすべて除去する。
細胞が塊状に見える場合は、皿の背面を上下に軽くピペット化して細胞懸濁液をさらにトリチュレートします。次に、自動化されたセルカウンターでトリパンブルーの除外を使用してセルを数えます。適切な量の細胞を除去し、15ミリリットルの円錐チューブ中の脱脂BSA中で1ミリリットル当たり10,000個および30,000個の細胞密度の細胞懸濁液を作成します。
卓上遠心分離機に固定角度ローターを使用して、細胞を300倍gで5分間遠心します。上清を吸引し、細胞ペレットを7ミリリットルの温められた脱脂BSA溶液で再懸濁する。その後、セルサスペンションを2つの15ミリリットルの円錐管(車両単独制御用、Ku55933用)に均等に分割します。
チューブローテーターを使用して、37°Cの細胞培養インキュベーターで90〜120分間チューブを回転させます。めっきの30分前に、各チューブにKu55933とDMSOを加え、最終濃度の10マイクロモルにします。残りの時間、セルのサスペンションをローテーターに戻します。
細胞をめっきする直前に、インキュベーターからプレートを回収し、脱脂したBSA溶液を吸引する。この後、各処理群から細胞懸濁液の500マイクロリットルを取り除き、24ウェルプレートのフィブロネクチンコーティングカバースリップの1つにそれぞれを加えます。プレートと細胞懸濁液を前の条件でインキュベートし続けます。
次に、細胞が所望の時間の間カバースリップに付着するようにします。接着のための所望の時間が経過した後、プレート内の各カバースリップから細胞溶液を吸引する。ウェルの側面をピペットダウンして、3.7%パラホルムアルデヒド溶液の500マイクロリットルを各カバースリップにそっと分配し、10〜15分待ちます。
次に、パラホルムアルデヒド溶液を取り出し、1回の洗浄につき500マイクロリットルのPBSを使用して1X PBSで各カバースリップを2回洗浄します。PBSを吸引し、各カバースリップに0.2%トリトンX-100と1X PBSの500マイクロリットルを室温で10〜15分間吸引します。その後、各カバースリップを1回のPBSを1回500マイクロリットルのPBSで1回洗浄します。
各カバースリップの細胞を、500マイクロリットルの免疫蛍光遮断バッファーで30〜60分間ブロックします。ブロッキングバッファー内の一次抗パキシリン抗体を1対250の比率で希釈します。よく混合し、各カバースリップに抗体溶液の200マイクロリットルを追加します。
室温で少なくとも1時間インキュベートする。この後、抗体溶液を吸引し、1XPBSの500マイクロリットルで各カバースリップを10分間洗浄します。この時点から前方の光からサンプルを保護します。
同じブロッキングバッファー溶液中の赤蛍光アレクサ 594 色素とヤギ抗マウス 488 蛍光二次抗体に結合したファロイジン F-アクチン プローブを希釈します。よく混ぜ、各カバースリップに200マイクロリットルの抗体溶液を30分間加えます。抗体溶液を吸引し、1X PBSの500マイクロリットルで各カバースリップを10分間洗浄します。
PBSを吸引し、カバースリップを500マイクロリットルの脱イオン水で一度すすいだ。次に、DAPIを含むアンチフェード実装媒体を使用して、カバースリップを顕微鏡スライドに固定します。抗パキシリン抗体による固定および染色後、REF52細胞の蛍光8ビットグレースケール画像が取得されます。
すべての画像処理ステップが完了すると、個々の焦点接着が目立ち、焦点を合わせ、容易に区別できる必要があります。抗パキシリンおよびファロイジンF-アクチンプローブ染色された細胞のグレースケール蛍光画像は、フィブロネクチンにメッキされた後に撮影される。顕著な焦点接着およびストレス繊維は、20〜30分間フィブロネクチンに付着させた後、REF52細胞で容易に見えるべきである。
細胞膜の先端にあるF-アクチン濃縮フリルは、矢印で示される。ファロイジンF-アクチンプローブと抗パキシリン染色の同様の蛍光画像を、細胞拡散中のストレス繊維の割合について分析する。特に、酸化剤処理は、検討したすべての接着時点でのストレス線維形成の有意な増加を引き起こし、かつ15分間の細胞接着後のフィブロネクチンへの細胞接着の減少を引き起こす。
高い細胞密度でめっきは、過剰なコンフルエンシーのために細胞が完全に広がることを禁止する細胞の混雑につながります。セルの端は隣接するセルと区別できないことに注意してください。その結果、個々の細胞の定量が排除され、周囲の広がりが正確に決定できない。
マウス胚性線維芽細胞の別の細胞株を懸濁液に保持し、その後、フィブロネクチンに30分間メッキする。次いで細胞を固定し、抗パキシリン抗体で染色した。フォーカスが合っていないセルに注意してください。
さらに、細胞デブリを有する抗パキシリン抗体の交差反応性は、定量的画像分析中に閾値を変化させ、分析に含めるべきではない。画像処理中に、フィジーの検索ツールを使用して画像ヒストグラムを調べながら、明るさ/コントラストを調整して、信号の飽和に関連する落とし穴を避けます。接着および拡散の変化は、細胞の移動に影響を与える可能性があります。
単一細胞の移動、創傷治癒、または化学運動法の浸潤アッセイを追跡する方法は、移動中に変化が起こっているかどうかを判断することができる。RhoファミリーGTPEsは、特定の空間的時間的活性化を通じて細胞接着ダイナミクスを調節します。酸化ストレス時の接着および広がりにおける表現性変化は、これらのタンパク質の下流調節の役割を示唆している可能性があります。
この方法では、BSL-II細胞株および有害な化学試薬を使用する必要があります。研究者は、施設の環境安全衛生事務所によって決定された化学的および生物学的安全訓練を必要とします。
