この方法は、新しいタンパク質またはタンパク質ドメインの注釈、既知のタンパク質の構造的および機能的特性の特徴化、タンパク質相互作用ネットワークの定義、または異なる条件における抗原抗体シグネチャなどのタンパク質ベースの研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、単一の遺伝子からゲノム全体に至るまで、あらゆる種類の研究に対して、完全に公平で高いスループットとモジュラーであることです。ドメイン1のライブラリの構築は、機能研究のために非常に有用です。
ファージディスプレイコンテキストに移管し、結合タンパク質や精製抗体などの異なる標的に対する選択に使用できます。NGSとの結合は非常に敏感で強力な分析を可能にする。同時に、特に開発されたウェブツールは、ドメインの全体と相互作用の正確な特性を与えます。
ORFライブラリを最初に構築するには、100%出力で30秒パルスでDNAを超音波処理します。超音波処理の後、1.5%アガロースゲルにはしごと超音波DNAをロードします。その後、電気泳動装置を15分間5ボルト/センチメートルで始動します。
アガロースゲル電気泳動は、超音波処理を確認するDNAスミアの存在を示す。これは、超音波処理を受けていないDNAから得られた固体バンドと比較してである。次に、断片化したDNAスミアでゲル部分を切断し、カラムベースのゲル抽出キットを用いて精製する。
UV分光光度計で精製されたDNAの濃度を測定します。その後、メーカーの指示に従い、迅速な鈍い酵素ミックスの1マイクロリットルで挿入物の5マイクログラムを扱います。その後、10分間摂氏70度で酵素ミックスを不活性化します。
濾過ベクターを調製するために、まず、精製クローニングベクターの5マイクログラムをEcoRV制限酵素で消化する。その後、1%アガロースゲルに消化および未消化のベクターと分子マーカーをロードします。その後、摂氏80度で20分間加熱不活性化します。
次に、ホスファターゼ酵素の5単位と10Xホスファターゼバッファーの1/10容量で消化されたベクターをリン酸化する。その後、15分間摂氏37度で混合物をインキュベートします。その後、5分間摂氏65度でホスファターゼ酵素を不活性化します。
次に、ゲルからプラスミドを抽出し、DNAを精製します。次に、UV分光光度計におけるDNAの濃度を測定する。ライゲーション反応を行うために、400ナノグラムのリン酸化インサートを消化されたベクターの1マイクログラム、10X T4 DNAリガーゼバッファーおよびT4 DNAリガーゼを最終体積100マイクロリットルに加える。
その後、ライゲーション反応を摂氏16度で一晩インキュベートします。翌日、熱は摂氏65度で10分間熱を不活性化する。次に、pH5.2で酢酸3モル酢酸ナトリウムの1/10容量を加え、100%エタノールの2.5容量を加え、ライゲーション生成物を沈殿させる。
DNAを沈殿させるには、試薬を混合し、マイナス80度で20分間凍結します。20分後、摂氏4度で20分間最高速度で遠心分離します。遠心分離後、上清を出します。
ペレットに、500マイクロリットルの冷たい70%エタノールと再び遠心分離機を加える。遠心の終わりに上清を捨てます。ペレットを空気乾燥したら、沈殿したDNAを10マイクロリットルの水に溶解する。
エレクトロポレーションを行う前に、氷上のマイクロ遠心チューブと0.1センチメートルのエレクトロポレーションキュヴェットを適切な数に配置してください。次に、精製されたライゲーション生成物の1マイクロリットルを細胞の25マイクロリットルに加える。次いで、DNAをピペットし、細胞混合物を冷電気ポレーションキュベットにし、チューブをフリックする。
その後、キュベットの外側から水を拭き、エレクトロポレーションユニットに入れてパルスを打つ。エレクトロポレーションが終わったら、キュベットの細胞に抗生物質をかけずに液体2X YT培地を1ミリリットル速く添加する。その後、細胞混合物を10ミリリットルのチューブに移します。
1時間37°Cで毎分220回転でシェーカーにチューブを残します。クロラムフェニコール、アンピシリン、クロラムフェニコールのみを補った10センチメートル2X YT寒天プレートにライブラリの希釈液をプレートします。これは、PCRによって試験される単一コロニーを得るために、そして滴定を行う。
次に、クロラムフェニコールとアンピシリンを補った15センチメートル2X YT寒天プレートに形質転換された管轄細胞をプレートします。その後、一晩摂氏30度でプレートをインキュベートします。翌日、彼らが数えられる希釈を選択するコロニーを数えます。
次に、ライブラリのサイズを計算します。ライブラリーサイズは以下のように計算され、平均コロニー数は希釈因子の総ライブラリ体積を掛け合う。ライブラリサイズは、6つのクローンの累乗に対して10の順序にする必要があります。
アンピシリン濃度がより多くのフィルタリングを行うことが最適である場合、クローン数はこの抗生物質の不在時に得られたものの1〜20に減少する。陽性のコロニーをテストするには、チップを使用して15〜20個のコロニーをピックアップします。その後、抗生物質なしで2X YT培地の100マイクロリットルでコロニーを希釈します。
次に、PCRはTaq DNAポリメラーゼを用いたDNA鋳型として0.5マイクロリットルの培養液を増幅する。PCR中、摂氏55度のアニーリング温度と摂氏72度で40秒の延長時間を使用して、増幅の25サイクルを実行します。挿入の長さが 150 から 750 の基本ペアの予想される範囲内にあることを確認します。
そして、その異なるコロニーは、異なるサイズで異なる挿入物を提示します。これは、可変性の点でライブラリの準備が良好であることを示しています。次に、新鮮な2X YT培地を3ミリリットルの新鮮な2X YT培地を150ミリメートルプレートに加え、細菌を採取します。
その後、滅菌スクレーパーを使用して細菌を収穫する。完全に混合した後、 20%グリセロールを追加し、将来の使用のためにアリコートでマイナス80°Cに残します。即時使用のために、グリセロールを添加する前に、ライブラリーのアリコートの一つからプラスミドDNAを精製するためにカラムベースのプラスミド抽出キットを実行する。
UV分光光度計でDNAの濃度を測定し、使用するまでマイナス20°Cでサンプルを保存します。PCR増幅のためのDNAテンプレートとして、ライブラリーの2.5マイクロリットルを使用してください。サーモサイクラーの条件を設定し、実行を開始します。
次に、インデックス PCR キットを使用してインデックス PCR を実行します。これにより、多重化された Illumina 実行内の二重インデックス化されたライブラリがシーケンスされます。次にサーモサイクラー条件を設定し、実行を開始します。
AMPure XPビーズで精製した後、サイズを確認し、バイオアナライザ上の最終ライブラリの1〜10希釈の1マイクロリットルを実行します。次に、最終的なライブラリ トレースの領域を選択して数値化します。これらの模式表現は、Pフィルターベクターにクローニングした後、ORFに対応するコロニーのみが抗生物質の存在下で機能的β-ラクタマーゼを産生することを実証する。
フィルタ処理後は20倍のクローン数の減少が予想される。良いフォルダORFは、より高い抗生物質濃度で成長しています。さらに、ORFフラグメントは、フィルタされたライブラリから容易に回収することができる。
ファージミドORFライブラリは、標的タンパク質または抗体に対してファージディスプレイ選択を行うために構築されます。その後、得られたすべてのライブラリと出力は、NGSによって深く分析されます。NGSは、選択した各断片のライブラリの多様性、豊富さ、および正確なマッピングに関する完全な情報を提供します。
最後に、開発されたinteractome seek webtoolは、ゲノム注釈を持つ推定ドメインのリストに至るまでの生のシーケンシング読み取りを生成します。このビデオを見た後、目的のDNAソースからドメイン化ライブラリを構築し、検証する方法をよく理解する必要があります。そして次世代シーケンシングによりライブラリのハイスループットスクリーニングを行う。
私たちは、Illuminaプラットフォームを使用してORFフィルタリングライブラリのシーケンスを最適化し、プログラミングスキルを必要とせずにこの種のデータの分析を可能にするウェブツールを開発しました。
