私たちは、優れた技術支援のためのモニカTarnowska、コーネリアアルブレヒトとエワSkoczylasに感謝したいと思います。この研究は、PPへのSNF SinergiaグラントCRSI33-125073によって資金を供給された。

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著者らは、競合する利害を宣言していません。

デザイナーヌクレアーゼ主導のゲノム編集アプローチが大幅にそれぞれのゲノム10,12のターゲット変更の影響を受けやすい種の範囲を拡大した。マウスでは、遺伝子標的ES細胞では、20年以上のための標準的な技術である;ラットES細胞におけるいくつかの最近の成功があったが、しかしながら、それは、マウス以外の種由来のES細胞に適応することが困難であることが証明されている。でも、このようなEUCOMM、KOMPとしてコンソーシアムが提供する「既製」遺伝子標的マウスES細胞クローンの利用可能性を持つ、またはNorCOMM 3ゲノム編集ZFNとTALENによることができる修正のスペクトルに関して、より高い精度と柔軟性を提供しますマウスゲノムに導入した。ヌクレアーゼ媒介変異を有する創始動物は、常に、ES細胞の胚盤胞の注入に起因するキメラの場合ではない、高度生殖系列有能4-6,20,21、ように見える。このように、DESの特定の場合に微量注入中ignerヌクレアーゼは、ターゲットを絞ったゲノム修飾を有する新たなマウス系統の大幅に高速生成をもたらすことができます。 ZFNとTALENの注入によるノックアウトマウスの正常な発生は、注入されたヌクレアーゼペアの活性に大きく依存。 TALENSは、生物の数の遺伝子の広い範囲を標的に高い成功率を有することが示されている;しかしながら、最近の研究は、TALEN結合はシトシンメチル30,31に感受性であることを示唆しているので、新たに生成されたヌクレアーゼ対は、例えばTALENSでのpCAG-T7ベクターにクローン化し、例えば、NIH-3T3または神経などのマウス細胞株に一過性にトランスフェクトすることができるある程度のマウス胚のクロマチン状態を模倣-2aは、。ここで、ヌクレアーゼ活性が従来mRNA合成およびマイクロインジェクションのセクション5で説明されるようにT7エンドヌクレアーゼアッセイまたはPCR産物の制限消化を用いて推定することができる。我々は尊敬に興味のあるゲノム領域の塩基配列決定を推奨アイブ細胞株およびマイクロインジェクション実験に使用したマウス株。 マウスの受精卵では、異なるTALENまたはZFNペアが異なるmRNA濃度で最適に動作するため、マイクロインジェクションし、ヌクレアーゼmRNAの最適な作用濃度は、実験的に決定する必要があります。高すぎる胚致死性をもたらすことができるのに対して、ヌクレアーゼペアに応じて、濃度が低すぎるのない切断が発生します。ヌクレアーゼの対に応じて、我々は、2 ngの/μlの200μgの/ ulのと同じ高程度の低い全mRNA濃度を使用して成功を収めている。これらの効果は、細胞培養および胚の生存および標的遺伝子座の変形速度の両方を経験的に決定する必要があるため、ヌクレアーゼの濃度で最適な実験から予測することは困難である。 高活性ZFNまたはTALENは顕微注入胚の1細胞期を超えて、その標的配列を切断し、このように変異誘発ANの複雑なパターンを引き起こす可能性があります創設者におけるDモザイク。我々は、他の4つのファウンダー（ 図5C）3つ以上の異なる突然変異対立遺伝子を観察した。これらの創立者からの新しいマウス系統を確立するときにこのように、子孫は慎重に消化アッセイは、未定義の変異が存在するのみであるという証拠を提供するので、有利な変異の存在のために配列決定することによりスクリーニングされるべきである。 批判の一つは、頻繁にZFNとTALENシステムに対して有声音これらのヌクレアーゼはまた、標的部位に類似しているゲノム中にどこかに存在する配列を切断することができるという可能性である。このようなオフターゲット効果は、ホモ二量体のFokIドメインを使用して初期の世代の試薬 ​​を用いて観察されており、ヘテロ二量体構築物は、オフターゲット効果25を軽減するために設計されていた。潜在的なオフターゲット部位は、 インシリコ 32,33 にある程度予測PCRおよび配列決定によりスクリーニングすることができる。明らかな利点のOfはマウスよりもむしろ細胞株を生成するためのZFNとTALENSを使用して、選択した野生型株にいくつかの戻し交配を行うことにより、所望のゲノム改変にリンクされていない標的変異をオフに除去する可能性がある。創始マウスの多数の分析のために、ヌクレアーゼ標的遺伝子座から、およびインシリコで生成されたPCR産物の次世代ディープシークエンシングは、オフターゲット遺伝子座がPCR産物の消化アッセイに別の定性的および定量的な読み出しを提供するかもしれないと予測した。 このプロトコルに記載の生殖補助技術は、C57BL/6J又はB6D2F1としてマイクロインジェクション実験のために使用される標準的なマウス系統のために最適化される。このような近交系株のような異なる起源のマウスは、原則的にゲノム編集アプローチを使用することができ、特定の研究課題に適し遺伝的背景を提供することがあります。このような過剰排卵などの生殖補助技術の性能はprediすることができます株34〜36の数CTEDが、ヌクレアーゼマイクロインジェクションのための胚の十分な数を得るために、非標準の株についてさらなる最適化が必要になる場合があります。 ZFNとTALENのほかに、そのようなRNA誘導CRISPR/Cas9システム9,37,38などの新しいデザイナーヌクレアーゼは現在、ゲノム編集アプリケーションのために導入されている。ここで説明する創始動物のマイクロインジェクションおよび分析のためのすべてのメソッドもCRISPR/Cas9ゲノム編集の将来のモードにも適用可能である。

マウスは、トランスジェニック動物モデルを生成するためのこれまでで最も人気のあるプラットフォームである。マウス胚1-3の遺伝子工学のための多目的なツールボックスは、最近では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、デザイナーヌクレアーゼに基づくゲノム編集アプローチによって4-6、転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を7,8に拡張されましたおよびクラスタ化され、定期的に互いに間隔を短くパリンドローム反復（CRISPR）/ CRISPR関連（CAS）9システム9。各FokIエンドヌクレアーゼ10月12日に連結されている2カスタム設計のタンパク質に基づくDNA結合ドメイン（ジンクフィンガータンパク質の配列をそれぞれ繰り返し変数をジ-残基（RVDS））のペアとしてZFNとTALEN機能。逆に、Cas9媒介DNA開裂の特異性は、CRISPR RNAをトランス活性によって提供される（また、単一のキメラRNA分子に組み合わせることができるcrRNAとtracrRNAは、ガイドRNAとも呼ばれる）11との複合体に作用するCRISPRタンパク質。 RVDSの定義された順序でTALENSは急速に13から17を選択するアセンブリ戦略の多数の個々の実験者によって構築することができる。 CRISPR/Cas9しかしガイドRNA-DNA結合の特異性は、まだ完全に18,19を解決しない、デザイナーヌクレアーゼのさらに少ない労働集約的な世代をお約束します。カスタムのZFNの生成は、これまで専門的な学術の研究室、およびこのようなサンガモBiosciences社とシグマCompoZrサービスとして、商業的な供給に限定されていた。 一般的には、デザイナーのヌクレアーゼで編集ゲノムは続いて非相同末端結合（NHEJ）または相同組換え（HR）DNA修復機械10,12を引き付ける定義されたゲノム遺伝子座、で二本鎖切断（DSB）を導入することを目指しています。 DSBのNHEJ媒介修理は、多くの場合、修理の現場に近接して挿入および欠失の導入になる。このようにNHEJリペアC遺伝子タンパク質コード配列の4,7,9内のフレームシフト変異を導入することにより標的遺伝子の機能をノックアウトするために利用される。代替的に、定義された追加又は遺伝情報の交換は、設計者ヌクレアーゼと共にDNA供与体を提供することによって達成することができる。 DNA供与体は、このようにHRによってDSB修復のための鋳型としての標的遺伝子座と相同な領域によって隣接治験設計のDNA配列を含む。両プラスミド5,6,20及び一本鎖オリゴヌクレオチド8,9,21正常ドナーとして使用されてきた。 NHEJ - ノルHR媒介ゲノム編集のいずれも、全体的な遺伝的構造を乱すことなく、塩基配列のわずかな変更を作成するためのこれらの戦略に特に適していますマウス胚のゲノム中に、選択マーカーの導入を必要とする。 このプロトコルでは、ゲノム編集のためのすべての基本的な手順を説明しますTALENSを使用して、マウスの胚。これらは、胚移植のための5）の外科的処置、受精したマウス卵母細胞へのTALEN mRNAの4）マイクロインジェクション、3）TALEN mRNAのインビトロ合成 、2）ゴールデンゲートによるTALENSの建設は13のクローンを作成、TALEN標的部位22の1）識別を含む創始動物におけるTALEN誘発される突然変異誘発、および6）分析。我々はTALEN mRNAのマイクロインジェクションとNHEJ誘発の挿入/削除の創設者のスクリーニングに焦点を当てています。この目的のために我々はプラスミドとして、マウス胚へのマイクロインジェクションのためのTALEN mRNAのin vitro合成にトランスフェクトされた場合、哺乳動物細胞の両方の発現を可能にする二官能TALEN構成物を生成した。これらの構築物は、ヘテロ二量体のFokIに融合し切り詰められた物語のバックボーン23は、哺乳動物細胞における最適なゲノム編集のために24,25のドメインからなる。このプロトコルは、他のデザイナーのヌクレアーゼのマイクロインジェクションのために、またはデザイナーのヌクレアーゼの組み合わせ注射のために採用することができるドナー構築物（DNA供与体の設計はWefers らにより優れた技術刊行物に記載されている。26,27）。 倫理的な声明全ての動物実験は、カントンチューリッヒのカントン獣医局のガイドラインと規則に従って行った。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="524">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">BsaI</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0535S or L</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">Esp3I</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ER0451</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">T4 Ligase</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S or L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Spectinomycin</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0692-1ML</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A0166</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">X-Gal</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B4252</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">IPTG</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I6758</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Plasmid-Safe nuclease</td>
			<td style="width:111px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">E3101K</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:111px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27106</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">QIAGEN Plasmid Midi Kit</td>
			<td style="width:111px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12143</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:111px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28106</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM1345</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">NucAway Spin Columns</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM10070</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">RNaseZAP</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R2020-250ML</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">NorthernMax Formaldyde Load Dye</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM8552</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">RNA Millennium Markers</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM7150</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">10x TBE buffer</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B52</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">T7 endonuclease</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0302S or L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">pGEM-T EasyVector System I</td>
			<td style="width:111px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A3600</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S-7563</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">pregnant mare&#39;s serum gonadotrophin (PMSG)</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G4877</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">human chorionic gonadotropin (hCG)</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CG5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">M2 embryo culture medium</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7167</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">M16 embryo culture medium</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7292</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Mineral oil, embryo tested</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8410</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Ketamine</td>
			<td style="width:111px;">CentraVet</td>
			<td style="width:119px;">Ket 201</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Xylazine</td>
			<td style="width:111px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">46995</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Equipment/Tools</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">Inverted microscope with Nomarski DIC optics (for example Nikon Eclipse TE200)</td>
			<td style="width:111px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">Micromanipulator units (for example Narishige, NT88NF)</td>
			<td style="width:111px;">&#160;Narishige</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Embryo holding capillaries</td>
			<td style="width:111px;">Sutter instruments</td>
			<td style="width:119px;">B100-75-10</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Embryo injection capillaries</td>
			<td style="width:111px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">GD-1</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">Capillary puller (for example Sutter P97)</td>
			<td style="width:111px;">Sutter instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Microforge (for example Narishige MF-900)</td>
			<td style="width:111px;">Narishige&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Walton skin scissors</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">14077-10</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">14041-10</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Surgical probe</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">10140-03</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Reflex wound clip system (9mm)</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">12031-09</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Reflex wound clips (9mm)</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">12032-09</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Dumont fine forceps 5</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Moria curvrd forceps</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11370-31</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Moria fine forceps</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11399-80</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Dietrich bulldog clamp</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">18038-45</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Animals</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">C57BL/6J mice</td>
			<td style="width:111px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:119px;">strain code 000664</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">CD-1 mice</td>
			<td style="width:111px;">Charles river</td>
			<td style="width:119px;">strain code 000664</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse genome engineering using designer nucleases

サイト固有のゲノム修飾（ノックアウト、ノックイン）を有するトランスジェニックマウスは、複雑な生物学的システムを解剖するためにだけでなく、ヒト疾患をモデル化し、治療戦略をテストするために極めて重要である。サイトのためのそのようなジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNは）、デザイナーヌクレアーゼ、転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENS）、およびクラスタ化され、定期的に互いに間隔を短くパリンドローム反復（CRISPR）/ CRISPR関連（CAS）9システムの使用の最近の進歩特定のゲノム工学は、胚性幹（ES）細胞技術に依存することなく、実質的に任意の実験室種において急速標的ゲノム改変を実行する可能性を開く。ゲノム編集の実験は、一般的に研究者が定義したゲノム遺伝子座にヌクレアーゼ活性を指示するために、カスタムDNA結合ドメインの構造が続き、目的の遺伝子の中にデザイナーのヌクレアーゼ標的部位の同定で始まる。デザイナーヌクレアーゼプラスミドは、in vitroである&lt;/ em&gt;は受精したマウス卵母細胞のマイクロインジェクションのためのmRNAを生成するために転写した。ここでは、受精したマウス卵母細胞にTALENのmRNAの直接注入の対象となるゲノム改変を実現するためのプロトコルを提供する。

私たちは、哺乳動物細胞におけるTALENSの発現ならびにT7ファージプロモーター（ 図1C）からのin vitro mRNA合成を可能にするサーマクら 13によって公開ゴールデンGateTALENアセンブリと互換性のあるデスティネーションプラスミドを構築した。これらのプラスミドは、FokIエンドホモ二量体と比較してオフターゲット効果を減少させ、第一世代のFokIヘテロ25,29と比較して、切断活性を増強することが示されているヘテロ二量体のFokIドメイン（ELDやKKRの変異）を運ぶ。ゴールデンゲートアセンブリ反応＃1と＃2は、通常、非常に効率的であり、すべての白いコロニーは、コロニーPCRで分析したとき、クローン化されたRVDS（ 図1Bおよび1D）の特定の数の予想パターンを示している。 in vitroで合成されたmRNAのゲル分析（ 図2）は、分析され、すべてのサンプルはほとんどまたは全く汚れを持つ単一の識別可能なバンドを明らかにしなければならない。成功したポリアデニル化を示したサンプルL1/R1とL2/R2、L3/R3、間に明確なサイズシフトがあるはずです。 創始動物は、酵素を使用するかT7エンドヌクレアーゼ消化、続いて遺伝子型決定PCR（ 図3）又は制限消化を用いNHEJ誘発突然変異した対立遺伝子についてスクリーニングすることができるヌクレアーゼ対のスペーサー領域内で切断する野生型配列（ 図4）こと。 T7エンドヌクレアーゼアッセイは、注入されたヌクレアーゼ対のスペーサー領域内にかかわらず、特定のゲノム配列の変異の任意の種類に適用可能である。しかし、ヘテロ二本鎖PCR産物におけるDNA鎖間のミスマッチのみを検出する。このように、創業者2同じように変異した対立遺伝子を運ぶ稀な事象で、PCR産物は、任意のT7消化パターンを示しませんでした。特定の制限部位は、NHEJにより除去されるヌクレアーゼスペーサ領域内に位置しているとき、そのような区別は常に、しかしながら、可能である誘発の挿入/欠失（ 図5）。ここで、未消化のバンドは、突然変異の存在を示し、任意の消化物の非存在下で強く（ 図4bにおけるアスタリスクでマークされた）標的遺伝子の両方の対立遺伝子における変異を有する創始者を示唆している。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1.jpg" width="600" /> 図1。 PFUのベクターへのRVDアレイのヘテロ二量体のpCAG-T7-デスティネーションベクターへTALEN RVDSのゴールデンゲートクローニング。A）アセンブリ。ここでの例は、（図示されていない、長い21 RVDSよりも物語のアレイに対して、3 PFUの-RVDSアセンブリが​​必要とされる）は、それぞれ、15 RVDSおよび17 RVDSを構成する個々の物語アレイとTALENペアのために示されている。矢印は、PFUの特異的コロニーPCR反応のためのプライマーを示す。B）PCR産物正しいPFUの集合体から増幅された、典型的RVDアレイの反復的な性質のためにクローン化されたすべてのRVDS（10 RVDS用などの周りの1.1キロバイト）の合計長さと小さく目立たバンドの「はしご」に対応するバンドを示す。C）最終組立PFUの-RVD·アレイと、それぞれFokIELDとFokIKKR亜種とのヘテロTALEN発現ベクターに、最後の繰り返し（PLR）を含むプラスミドの。 （NおよびCとして注釈）TALEN骨格は、T7ファージプロモーターで可能にしながら、CAG（CMV初期エンハンサーエレメント/ニワトリβ-アクチン）プロモーターが、トランスフェクトされた哺乳動物細胞中で高い発現レベルを保証するMiller ら 23によって発行アーキテクチャに類似しているインビトロ mRNA合成（ヌクレアーゼSTOPコドンの下流のベクターの線形化のためのSacIを用いる）。D）Cの矢印に示すプライマーを用いてコロニーPCR）は正確に組み立てTALENSの同定を可能にする。フルlengt「ラダー効果は「成功アセンブリの堅牢な指標を表しているH PCR産物は、多くの場合、あまり顕著である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2.jpg" width="300" /> 図2。アガロースゲル電気泳動を用いてインビトロ合成におけるヌクレアーゼmRNAの品質管理のZFN mRNAが例として示されている（Lは、ZFNを残し、R、右ZFN）。サンプルは前ポリアデニルにmRNAを示しL1/R1、mRNA及びL3/R3ポリアデニルサンプルL2/R2のショーは、精製されたポリアデニル化mRNAを示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img<html> ALT FO =「図3」：SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3highres.jpg&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3.jpg&quot;幅= &quot;600&quot;：FOコンテンツ幅= &quot;6インチ&quot; /&gt; 図3。標的遺伝子座のヌクレアーゼ誘発変異を有する創始動物の同定のために使用されるT7エンドヌクレアーゼアッセイの例。 A）TALEN対は、マウスプリオンタンパク質遺伝子（PRNPのコード領域内で切断するように設計された、TALEN標的配列）は、要求に応じて提供することができる。 PCR産物を、110上流bpおよびリバースプライマー（R）TALEN切断部位の下流の250塩基対に位置するフォワードプライマー（F）を用いて生成される。B）PCR産物は、その後、ヘテロ二本鎖形成およびT7エンドヌクレアーゼ消化に供される。C）シングル創設者の目標とするゲノム領域内TALEN誘発される突然変異誘発は、250と110 BPSの消化産物との完全長PCR産物の存在によって明らかにされている。50930/50930fig3highres.jpg &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。 <img alt="図4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4.jpg" width="600" /> 図4。標的遺伝子座のヌクレアーゼ誘発変異を有する創始動物の同定のために使用されるPCR産物の制限消化の例は 、マウスRosa26遺伝子座のためのZFNの特異的29標的XbaI制限部位、イントロン1以内A）創設者は、使用してPCR遺伝子型決定によりスクリーニングしたフォワードプライマー（F）は500上流bpおよびリバースプライマー（R）切断部位。Bの下流250 bp）をXbaIでPCR産物の消化がアスタリスクでマークされた2対立遺伝子変異を持つマウスを（）を示す消化パターンを明らかにし、モノを置か対立遺伝子変異（消化し ​​、未消化のバンド、 例えば動物2）および潜在的な2対立遺伝子の改変によるマウスのwtマウス（完全な消化、 例えば動物21）。C）配列決定により、3（動物24）明確な挿入/欠失に表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> プライマーの名前 </td><td> &#39;から3&#39;配列5 </td></tr><tr><td> pCR8_F1 </td><td> ttgatgcctggcagttccct </td></tr><tr><td> pCR8_R1 </td><td> cgaaccgaacaggcttatgt </td></tr><tr><td> TAL_F1 </td><td> ttggcgtcggcaaacagtgg </td></tr><tr><td> TAL_R2 </td><td> ggcgacgaggtggtcgttgg </td></tr><tr><td> TAL_Seq_5-1 </td><td> catcgcgcaatgcactgac </td></tr></tbody></table> 表1。ゴールデンゲートTALENアセンブリ内のコロニーのPCRおよび配列決定のために使用したプライマーの配列プロトコル。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> プラスミド/コレクション </td><td> 貢献者 </td><td> Addgene ID </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>ゴールデンゲートTALENと、TALエフェクターキット2.0 </td><td> Voytasラボ</td><td> 1000000024 </td><td>ゴールデンゲートTALEN組み立てに必要な全てのプラスミドが含まれています</td></tr><tr><td>のpCAG-T7-TALEN -KKR/ELDのデスティネーションベクター</td><td> Pelczarラボ</td><td> 40131、40132 </td><td>アドオン、哺乳動物細胞およびin vitro mRNA合成における TALEN発現用プラスミド</td></tr></tbody></table> 表2。ゴールデンゲートTALEN組立に必要なプラスミド及びプラスミドのコレクションはAddgene（から入手でき <a href="http://www.addgene.org">www.addgene.org</a> ）。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> オンラインリソース</td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> http://tale-nt.cac.cornell.edu </td><td> TALENの設計; TALENオフターゲット予測</td></tr><tr><td> http://zifit.partners.org/ZiFiT/ </td><td> TALEN、OPEN ZFN、CODA ZFN、CRISPR/Cas9のデザイン</td></tr><tr><td> http://www.genome-engineering.org </td><td> TALEN、CRISPR/Cas9の設計; CRISPR/Cas9オフターゲット予測</td></tr><tr><td> http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.html </td><td> TALENのアセンブリは、配列決定の結果を確認するための配列</td></tr><tr><td> http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.html </td><td>モジュールアセンブリZFNのデザイン</td></tr><tr><td> www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab / segallabsoftware </td><td>モジュールアセンブリZFNのデザイン</td></tr></tbody></table> 表3。 ZFN、TALEN、およびCRISPR/Cas9を設計するためのオンラインリソース。 </strong&gt;

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Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

このようなジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNを）および転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENS）などのデザイナーヌクレアーゼは非相同エンド入社（NHEJ）と相同組換え（HR）経路の両方をトリガすることによって、マウスの着床前胚のゲノムを変更するために使用することができます。これらの進歩は、正確な遺伝子改変マウスの迅速な生成を可能にする。

デザイナーヌクレアーゼを用いてマウスゲノムエンジニアリング

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

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Research

JoVE Journal

Biology

28.5K ビュー.  University of Zurich. このようなジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNを）および転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENS）などのデザイナーヌクレアーゼは非相同エンド入社（NHEJ）と相同組換え（HR）経路の両方をトリガすることによって、マウスの着床前胚のゲノムを変更するために使用することができます。これらの進歩は、正確な遺伝子改変マウスの?...

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Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

アダルトゼブラフィッシュの内耳感覚上皮のグロスとファイン解剖（ゼブラフィッシュ）

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

生物学

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

マイクロアレイを用いたtRNAのアミノアシル化（充電）レベルのゲノムワイド解析

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

アイソフォーム特異的遺伝子標的を同定するためのチップを使用してゲノムワイド解析

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

生体イメージングおよび卵巣癌の同所性マウスモデルにおける治療的処置の

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

ミッションターゲットIDのライブラリを使用してmiRNAのターゲットのゲノムワイドスクリーン

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA "half-site" of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers "home" to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator&#x2019;s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

The CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) Service enables precise genome editing in any organism or cell line at any locus defined by the user. This article describes the process for the design, manufacture, validation and implementation of the CompoZr Custom ZFN Service.

CompoZrカスタムジンクフィンガーヌクレアーゼによるゲノム編集（ZFNs）

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

ゼブラフィッシュを用いた病的ヒトゲノムの in vivoモデルで

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

ゲノム編集中<em&gt;アステュアナクスmexicanus</em&gt;使用して転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...