これは、透明帯およびレンチウイルス遺伝子の送達のレーザー穿孔を介して受精マウス卵に関心のある遺伝子を送達するための代替的かつ使いやすい方法である。マウスドナー処置のレーザー支援穿光は、他の種類のウイルスまたはトランスフェクション試薬の侵入を促進するための他の種の受精卵にも適用可能である。この技術の主な利点は、受精したマウスの卵のマイクロマニピュレーションとマイクロ注入のための専門的なスキルを必要としないことです。
受精マウスの卵の分離手順を実証することは、NIEHSの比較医学支部の研究科学者であるPageマイヤーズです。交尾後16〜24時間、標準的なプロトコルに従って、膣プラグを持つ雌マウスから卵巣および卵巣ダクトを分離する。すべての組織が採取されたら、各卵巣のアンフェッラを引き裂き、Cumulous細胞に囲まれた受精卵を放出し、生のM2培地中の1xヒアルロニダーゼを含む35ミリメートル皿に、室温で3〜5分間インキュベーションする。
卵を数回ピペットしてキュムラス細胞を放出し、M2培地を含む新しい35ミリメートル皿に卵を移し、ピペット処理して酵素を洗い流す。次に、洗浄した卵を、シンプレックスカリウム最適化培地、またはKSOMを含む35ミリメートル皿に移し、ピペットを残りのM2培地およびヒアルロニダーゼを洗い流す。その後、卵を30ミリの組織培養処理プレートに移し、50マイクロリットルのKSOMとジメチルポリシロキサン2ミリリットルを摂氏37度、炭酸ガス5%と酸素、90%窒素で2時間平衡化します。
卵がインキュベーターにある間、メーカーの推奨事項に従って、XYCloneレーザーを設定して較正します。卵の準備ができたら、最初のドロッププレートをレーザー顕微鏡ステージに置き、手動で透明帯に焦点を合わせます。レーザーLED光が目的を通して見えることを確認した後、レーザーステージを動かしてLEDレーザーでゾナをターゲットにし、コンピュータソフトウェアを使用してXYCloneレーザーを250マイクロ秒に設定します。
LEDライトサイズを適切な寸法に調整し、各卵の透明物をレーザーで3回穿孔し、10マイクロメートルの穴を3つ生成します。受精卵は15分以上インキュベーターの外に保てることができないので、穿穿を迅速に行うことが重要ですが、慎重に行うことが重要です。その後、穿卵卵をさらに2時間保育器に戻す。
2回目のインキュベーションの終わりに、50マイクロリットルのKSOM降下を混合することなく2マイクロリットルの濃縮レンチウイルスで治療する。そして、4日間インキュベーターに卵を返します。卵が胚盤胞に発達した場合、非外科的胚移植装置を使用して、約10〜15個の胚をKSOMの約2マイクロリットルに沈着させた。
胚移植の17日後、妊娠中のマウスが自然に出産することを可能にするか、必要に応じて帝王切開で新生児を採取する。次いで、遺伝子生成のための子犬から組織を採取し、トランスジェネシスの速度を決定する。単離および導入されたマウス受精卵の発達は顕微鏡の下で毎日点検することができる。
健康で未治療の胚の60~70%が3~4日以内に胚盤胞に発達する。レーザー穿刺されたトランスデューセド胚の約47%が胚盤胞に発達し、その85%が目的のtranduc遺伝子を発現する。レーザーを薄くすることを目指して、穴を作成する代わりに、開発中の胚は、レンチウイルス伝達に寛容のままで透明なゾナをカプセル化し、そのままの恩恵を受けることができます。
組換えレンチウイルスによるトランスダクションは、伸び因子1AプロモーターからコペポッドGFPを発現し、複数のレンチウイルス集積を誘導し、青色LEDランプ下でのGFPの高発現を示す。この手順を試みる一方で、レンチウイルスが宿主ゲノムに統合する能力は、安定した遺伝子送達のための強力なツールとなる一方で、ランダムな統合は挿入突然変異を導入する可能性があることを覚えておくことが重要です。この技術は、遺伝学の分野の研究者が、生体内タンパク質産生のための疾患の研究、または機能的遺伝子研究のためのトランスジェニック動物モデルを迅速に開発することを可能にする可能性がある。
この手順に従って、免疫組織化学のような他の方法は、様々な組織における遺伝子発現の場所および程度に関する追加の質問に答えるために、導入された子犬からの単離された組織サンプルに対して行うことができる。レンチウイルスの使用は非常に危険な場合があることを忘れないでください。したがって、レンチウイルスを扱うためのあなたの制度ガイドラインに従ってください。
個人的な保護服を着用し、処分前にすべての廃棄物を除染します。
