この作品は、ウェルカムトラスト助成WT091939MAによって賄われていた。アランフィルーは王立協会によってサポートされています。

1。菌株と文化<ol><li> （標準CaCl 2の治療またはエレクトロポレーションを用いて）15 大腸菌を形質転換することにより大腸菌受容細胞を（餌、P）のエンジニア大腸菌lacZ遺伝子（ 表1）の相補性を可能にするプラスミドとDH5α細胞。プレート40 mg / mlの最終濃度と適切な抗生物質で、5 - ブロモ-4 - クロロ - インドリル-β-D-ガラクトピラノシドを含有するルリア - ベルターニ寒天プレート上で形質転換された細胞（LBA、1.5％寒天）（X-gal）を。 37℃で一晩、翌朝（§1.3参照）青形質転換体を選択。 </li><li> T6SS活性である緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ドナー細胞を成長させる（D +）またはT6SS不活性（D）（表1）一晩、LBAで37℃この例では、我々はPを使用ここで提示緑膿菌RETSは所持ひずみ恒常的に活性なH1-T6SS 16およびH1-T6SS遺伝子クラスター（ 表1）の欠失を持つ同質遺伝子変異。 </li><li>翌日、 大腸菌のうち、明るい青色のクローンを接種することにより通気フラスコ中で一晩培養液を準備プレートからの形質転換体（P）は、適切な抗生物質を補充したトリプシン大豆ブロス（TSB）5mlに、§1.1で説明した。 37℃で攪拌下で育つ℃、 §1.2で説明したプレートから- （D）（D +）との単一のコロニーを均等に進みます。 </li></ol> 2。競合アッセイ<ol><li>翌日、実験のためのLBAプレートを準備します。これらのプレートが適切に（ブンゼンバーナーの近くや層流キャビネット内のいずれか）を乾燥させていることを確認します。株について&quot;アッセイ入力&quot;（入力）プレートを準備します（D +）、（D - ）、および（P </strong&gt;）。 &quot;アッセイ-出力&quot;（出力）菌株用のプレートを準備します（ - D + P）と（D + P）。分割し、それに応じてプレートにラベルを付けます。 </li><li>一晩増殖させた後（§1.3参照）、入力細菌培養（ - D、D +とP）の光学密度（OD 600nmの ） を測定し、各菌株の1単位OD 600nmの細胞密度に相当を取得するために必要な量を計算し。それぞれの&quot;入力&quot;細胞培養（D - 、D +とP）が最初に滅菌1.5mlエッペンドルフチューブに回収されています。 </li><li>室温で1分間に13,000 rpmで細菌サンプルを遠心分離し、上清を捨てる。 </li><li> 、D +と新鮮なTSBの100μlのP文化、穏やかにピペッティングし、各対応の10ミリリットルを接種- Dのペレットを再懸濁し&quot;A入力&quot;プレート（§2.1で調製したもの）上の単一のスポットとしてひずみをsponding。 </li><li> &quot;A-出力&quot;プレート（§2.1で調製）接種する。 2つの別々のエッペンドルフチューブ（使用する文化がそれらの§2.4で説明されていることに注意）で30ミリリットル（P）と-より正確には、静かに30μlの（P）および30μlの（D）と（D +）30μlを混ぜる。ミックス（D + / P）の20μlを接種すると、（D - A / P） &quot;出力&quot;プレート上の個々のスポットとして。スポットが近くブンゼンバーナーを乾燥や細菌の殺害が行われている間、適切な期間を37℃のインキュベーターでプレートを配置することができます。 Pの場合にはT6SS欠損株を持つアクティブT6SSを比較するときに緑膿菌 、効率的な殺菌を5時間のインキュベーション後に観察される。 </li></ol> 3。 tの定性的観察彼殺菌<ol><li>アッセイの読み出しのための40μg/ mlのX-galを含むLBAのプレートを準備します。プレートは、混合細菌文化を発見し、こうして殺し性能を読んで &quot;読み出し入力&quot;または &quot;R入力&quot;単離された細菌を発見するか、または &quot;読み出し出力&quot;または &quot;R-出力&quot;と呼ばれるでしょう。これらのプレートはきちんと乾燥させることも必要です。その裏に4等分にプレートを分割して0、10 -1、10 -2、10 -3、これらの部 ​​分に注釈を付け、（§3.3参照）寒天プレート上のスポットに細菌培養物の希釈物を指定する。希釈は、同じスポット内の青/白バクテリア比の半定量的評価が可能になります。 </li><li> &quot;入力&quot;プレート（§2.4参照）から滅菌ループ個々の細菌スポットと &quot;出力&quot;プレート（§2.5参照）を用いて収集し、TSBの1ミリリットルを含む別個の1.5mlエッペンドルフチュー​​ブ内の各スポットを再懸濁します。効率的に再懸濁するために30分間エッペンドルフシェーカーブロックに置き細菌。 </li><li> TSBの900μlを含む5回3エッペンドルフ管のシリーズを準備して、最大10 -3〜10倍段階希釈液に再懸濁した各スポットのために進んでください。ピペットチップを変更し、各希釈段階の間に渦を5秒にしてください。 </li><li> 、無希釈懸濁液に最も希釈始まるまでに40μg/ mlのX-galを含むよく乾燥したLBAのプレート上に§3.3で調製したあなたの細菌の希釈液のスポッティング &quot;のためにこれらの&quot; R入力 &quot;プレートを作るに進みます入力&quot;スポットと&quot; A-出力&quot;スポット（ 図2）R出力&quot;のプレート&quot;。均質細菌懸濁液を維持するためにスポッティングに進む前に、簡単に渦各チューブを。結果の再現性については、象限内の三連でスポット20μlを（ 図2）。スポットが個別にプレート上で分離し、互いに向かって滑空しないままにする必要があるので、お皿の相対的乾燥度は、この段階では重要である。 競合アッセイの定量化は、実験のこの段階でも可能です。ステップ3.3に続いて、40μg/ mlのX-galを含むプレート上のLBA 10 -3希釈液100μlを広げた。結果の再現性については、 &quot;出力&quot;プレートから各スポットについて三重のめっきに進みます。 ℃インキュベーターで一晩（16時間のインキュベーションに相当）は37に希釈プレートを置きます。青色のコロニー（生き残っP細胞）のカウントに進みます。競争の5時間後に得られた典型的な結果を図3に示します。 </li><li>各スポット内に過剰の液体の吸収を可能にするために、無菌ゾーン内プレートオープン（NO蓋）のままにします。 </li><li>一晩37℃のインキュベーターでプレートを置きます。このインキュベーション時間の間に、殺害はまだ両方の株が接触して残っているので、（D + / P）をミックスで発生している。 </li><li>写真を撮るまたは出力の分析（ 図2）のためのあなたのプレートをスキャンしてください。スポットは大部分が青のままそれはどこにいることを示し、E.大腸菌はPによって殺されていない緑膿菌 。それがそうであるときに、E.大腸菌は T6SS欠陥のPで混合される緑膿菌株 （D）（図2、右下のプレート）。 </li></ol>

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我々は、開示することは何もない。

この記事で紹介した方法はT6SS媒介性殺菌/静菌活性を目視することができます。アッセイは、寒天プレートの表面上で実行されます。これは、予め混合菌液の培養で行わT6SS依存殺傷アッセイがないため、2つの細菌8の間に安定した接触の不足の可能性が高い、効率的ではないことが示されている。 T6SSは、標的細胞17にDNAを注入するためにバクテリオファージで使用されているものと同種のメカニズムで動作するように考えられている。液体培養では、T6SSのチューブ状の構造がより簡単に壊れる可能性があり、相互に細菌の接触が失われる可能性があり、毒素を効率的に配信されません。 インキュベーション時間の面では、我々はドナー株と獲物の間に記述する接触の5初期時間はPと殺菌を観察するのに十分である緑膿菌と大腸菌 図3に示すように、 大腸菌 、 </strong&gt;。それにもかかわらず、それは実験条件を最適化するために運動を行うことにより、インキュベーション時間を調整することをお勧めします。 このメソッドが色ベースの技術であるため、出力結果は、ドナー株の色素沈着が損なわれることがあります。例えば、Pの場合には緑膿菌 、一部の菌株は、獲物との区別は比較的困難にし、アッセイ読み出しを妨害することができるようピオシアニンとpyoverdineとして着色顔料を高レベルで生産しています。そのようなマゼンタ-galまたは赤ギャルのような他の発色性β-ガラクトシダーゼ基質は、X-galを（ 表1）の代わりに使用できます。 競合アッセイは、読み出しのために他のレポーター遺伝子を利用することができます。例えば、同じようなアッセイはまた、緑色蛍光タンパク質で標識した餌12を用いて行われてきた。 我々のアッセイは、定量的ではないながら、良い指標を与えるそれは生存またはレポーター獲物の殺害に基づいているのでT6SS活動の。この手法は、任意の細菌種からT6SSsの殺菌/静菌活性を評価するのは簡単で便利であるという利点を提示します。これまでのところ、T6SSの活性はグラム陰性菌に対して示されており、T6SS敏感なグラム陽性菌の明確な例はまだ12報告されていない。それは、（ 例えば 、成長温度、酸素化、特定のメディア）は、異なる細菌種の文化の中での非互換性をテストすることは明らかであると考えられるべきである。 我々のアッセイはまた、分泌毒素の痕跡が獲物を殺すのに十分であるかもしれないので、絶対に必要不可欠であるT6SSコンポーネントのかを評価するために使用できます。 T6SSの弱い活性が明らかに培養上清及びウェスタンブロットを用いて標準的な手順のテストT6SS依存分泌に比べて我々のアッセイによって検出される可能性がある解析。しかし、適切なコロニー形成単位（CFU）のカウントがまだこのT6SS活動を正確に定量するために必要です。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> 緑膿菌 PAKΔRETS（D +） （アクティブT6SS） </td><td>ラボ株</td><td></td><td>文献16に記載されて</td></tr><tr><td> 緑膿菌PAKΔRETSΔH1-T6SS（D - ）（非アクティブT6SS） </td><td>この研究</td><td></td><td> H1-T6SSクラスタが （遺伝子PA0070へPA0095を包含する）文献18に記載されている手順に従って対立遺伝子交換によって削除されました。最大フラグメントプライマー：ミューテータ断片をプライマーの下記のセットで生成されました： 5&#39;-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3 &#39;、および 5&#39;CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3 &#39;。ダウン断片プライマー： 5&#39;-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3 &#39;、 <pre> 5&#39;-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3 &#39; </pre></td></tr><tr><td> 大腸菌 DH5α </td><td>インビトロジェン</td><td> 18258-012 </td><td> F-φ80LACZΔM15Δ（lacリZYA-argは F）はU169 REC A1の終わり A1 HSD R17（R K - 、K +メートル） フォー商標E44λ-THI -1 GYR A96 REL A1 </td></tr><tr><td>たpBluescript II SK（+） </td><td>アジレント</td><td> 212205 </td><td>このベクトルは、α-相補性を用いられるβ-ガラクトシダーゼのαペプチドを発現する。 </td></tr><tr><td>のX-gal </td><td>インビトロジェン</td><td> 15520-018 </td><td> 40μg/ mlの濃度で使用</td></tr><tr><td>ルリアベルターニ寒天</td><td>メルク化学品</td><td> 1.10283.0500 </td><td></td></tr><tr><td> TSB（カゼイン大豆ブロス） </td><td>オキソイド</td><td> CM109 </td><td></td&gt; </tr><tr><td>ボルテックスシェーカーの天才3 </td><td> IKA </td><td> 3340000 </td><td></td></tr><tr><td>スキャナー</td><td>エプソン</td><td> V700 </td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td> WPA Biowave </td><td> CO8000セル密度計</td><td></td></tr><tr><td>マゼンタギャル</td><td> Bioworld </td><td> 30350001から1（715241） </td><td></td></tr><tr><td>赤ギャル</td><td>研究有機物</td><td> 1364c </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表1使用した菌株、プラスミド、材料および試薬。 </td></tr></tbody></table>

a visual assay to monitor t6ss-mediated bacterial competition

VI型分泌系（T6SSs）は、グラム陰性菌は、標的細胞の1,2の多種多様にタンパク質を輸送して注入することができる分子ナノマシンです。 T6SSは13コア·コンポーネントで構成されており、バクテリオ3のテール管と構造的類似性を表示しています。ファージは、標的細菌の細胞エンベロープに浸透し、DNAを注入するチューブと穿刺装置を使用しています。それはT6SSが表面にエフェクターや毒素を駆動するために、細菌の細胞エンベロープ内の特定のパスを作成するバクテリオファージ反転装置であることが提案されている。プロセスはさらに取ることができるとT6SS装置は、このように、これらの目標にエフェクターを注入し、細菌が接触している他のセルを穿孔可能性があります。尾管とT6SSの穿刺装置の部品はそれぞれ4,5、HCPとVgrGタンパク質で作られています。 T6SSの汎用性がsを通じて実証されている様々な細菌性病原体を使用してtudies。 コレラ菌 T6SSは、C-末端アクチン架橋ドメイン6,7を運んで &quot;進化&quot; VgrGを注入することにより、真核生物宿主細胞の細胞骨格を改造することができます。もう一つの顕著な例は、最近、従って特定の微生物ニッチと競争環境8,9,10の中の細菌の設立を推進し、T6SSに依存した方法で細菌を標的とし、殺すことができ、緑膿菌を用いて記述されていました。 後者の場合、すなわち3 T6SS-分泌タンパク質、コード番号、Tse2とTSE3は標的細菌（ 図1）に注入された毒素として同定されている。ドナー細胞は、抗毒素Tsi1によって媒介されるメカニズム、Tsi2とTsi3免疫タンパク質8,9,10を介してこれらのエフェクターの有害な影響から保護されます。 T6SS-堪能細菌がsで共培養しているときにこの抗菌活性をモニターすることができます他の細菌種と同じ種または8,11,12,13のT6SS不活性細菌との競争の中で悪臭のする表面。 入手可能なデータには、抗生物質メーカーに大きく依存して時間がかかるのCFU計数を含めて、細菌の競合アッセイへの数値的アプローチを強調した。 Pのような抗生物質耐性菌の場合には緑膿菌は 、これらの方法は不適切であることができます。また、100以上の細菌ゲノム14で約200の異なるT6SS遺伝子座の同定と、簡便なスクリーニングツールが非常に望ましい。我々は使いやすいですし、標準的な実験材料と試薬を必要とするアッセイを開発した。この方法は、lacZ遺伝子の相補性を可能に獲物としてレポーター株（この場合大腸菌 DH5α）を使用してT6SS依存殺菌/静菌活性をモニターするための迅速かつ定性的な手法を提供しています。全体的に、この方法があるgrapをHICと寒天プレート上T6SS関連表現型の迅速な同定を可能にする。この実験プロトコルを考慮に、このような接触の増殖培地、温度や時間などの特定の条件を取って他の株や細菌種に適合させることができる。

典型的な結果は、 表1に記載された株と試薬と図1に示します。この図に示すようにプレートを一晩インキュベートした後にスキャンした。 &quot;読み出し - 入力&quot;プレートは、このアッセイで使用菌株の連続希釈パターンを示す。予想されたように、 大腸菌大腸菌lacZ遺伝子はドナーP.ながら、X-galで補充した培地上で青く見えるスポット（P）の過剰発現を捕食緑膿菌株（D +、T6SSアクティブ）と（D - 、T6SS非アクティブ）白のまま。 &quot;読み出し出力&quot;プレートは、どの獲物とT6SSアクティブ株（D + A / P）との間のミックスは、このようにそれが殺されたことを示す青色の獲物の消失を示す目撃されています。これは、獲物をoutcompeteするドナーの能力を示しています。 （上の青色の持続- D / P）はプレートが青獲物を殺すために非アクティブT6SSドナーのできないことを示しています。 <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。 大腸菌の死滅T6SS-堪能P.の大腸菌緑膿菌、P. 緑膿菌は、大腸菌に毒素を注入T6SS依存的に大腸菌は、標的細胞（白矢印）。二つの毒素東証とTSE3は（オレンジと赤の丸）、E.に注入され大腸菌のペリプラズムとペプチドグリカン9を劣化させる。 Tse2毒素（黄色の丸）が大腸菌に注入され大腸菌の細胞質と菌活性8,10を持っています。毒素の複合作用は、標的細胞（雷や頭蓋骨のフラッシュ）殺す。標的細胞の生存は、（ 図2参照）を作製したβ-ガラクトシダーゼの活性を監視することによって検出することができますが、P. Aeruginosaは免疫タンパク質Tsi1、Tsi2とTsi3（オレンジ、黄色、赤の広場、それぞれ）8,9,10によって毒素の活動に対して保護されています。 <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2.jpg" alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2highres.jpg"/> 図2。寒天プレートアッセイはT6SS依存殺菌を監視するために、この図では上部Dの連続希釈液からなる&quot;読み出し-入力&quot;プレートに表示されている-は、D +、およびP入力セル。開裂のX-galというPの入力セルは、β-ガラクトシダーゼ青lacZ遺伝子のα-相補性に起因してこのようにして製造されています。下部には（D + / P）がアクティブの間に細菌の混合の連続希釈液からなる&quot;読み出し出力&quot;のプレートを示されています</strオング&gt;、または非アクティブ（D - A / P）、T6SSドナーP.大腸菌と緑膿菌株大腸菌は食い物にする。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50103/50103fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するにはここをクリック</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。 Eの殺害の定量P.の大腸菌 5時間のインキュベーション後に緑膿菌 。グラフは、 大腸菌のCFU計数を提示大腸菌は 3.4ステップで説明。結果は、殺害のほとんどは接触の初期5時間の間に行われていることを示唆し、T6SS +とT6SS-株の間に3倍の差を示してここに提示した。

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A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

我々は競争によって媒介される細菌を監視するための定性分析を記述<em&gt;緑膿菌</em&gt; VI型分泌系（T6SS）。アッセイは運ぶ大腸菌標的細胞の生存/殺害に依存している<em&gt; lacZを</em&gt; - レポーター。この手法は、T6SS-堪能微生物の殺菌/静菌活性を評価するために調節可能である。

T6SS媒介細菌競争を監視するには、Visualアッセイ

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

a-visual-assay-to-monitor-t6ss-mediated-bacterial-competition

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.5K ビュー.  Imperial College London. 我々は競争によって媒介される細菌を監視するための定性分析を記述緑膿菌 VI型分泌系（T6SS）。アッセイは運ぶ大腸菌標的細胞の生存/殺害に依存している lacZを - レポーター。この手法は、T6SS-堪能微生物の殺菌/静菌活性を評価するために調節可能である。

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Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

マウスでイメージ細菌感染にルシフェラーゼを用いた

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

免疫・感染学

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

M細胞による細菌の取り込みを評価するパイエル板腸管ループアッセイを連結したマウスのアプリケーション

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

定性的にオーバーレイアッセイを使用すると、肺炎球菌バクテリオシンに対する細菌の産生と感度を測定します

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

ヒト免疫不全ウイルスの複製フィットネスを決定するためのペアごとの成長競合アッセイ

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

牛にエフェクターおよびメモリーT細胞応答を評価するための長期培養インターフェロンγ酵素結合免疫アッセイの応用

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

発生とのマルチ表現型ハイコンテンツスクリーニング<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;トランスポゾン変異体

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

細菌胞子の発芽中に皮質断片を検出

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

放線菌突然変異体のビジュアルと顕微鏡的評価

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

高スループット赤痢菌-特定の殺菌試験

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

病原性細菌に対する免疫学的応答を評価するための Opsonophagocytic 殺害アッセイ

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...