この方法は、巨核球などの頭蓋骨マウスの骨髄で起こり、脳内のプロ血小板を伸ばして、異なる事象のリアルタイムで可視化することを可能にする。この技術の主な利点は、炎症反応を最小限に抑えるために必要なマイナーな手術であり、ほぼ工場の状態でのイベントのインビボビジュアライゼーションを可能にする。開始するには、マウスを撮像室に搬送します。
顕微鏡とコンピュータの電源を入れ、必要なパラメータを設定します。マウスが完全に麻酔をかけられたら、加熱されたプレートの上にマウスを置き、次のすべての操作のために摂氏37度に温め、マウスの頭と喉を剃り、乾燥を防ぐために目にゲルを塗ります。背中にマウスを置き、喉を伸ばすために外科用テープで前脚を固定します。
喉を消毒した後、はさみを使用して右または左の頸静脈の上に0.7〜1センチメートルの切開を行い、隣接する結合組織を伸ばして胸筋の上に外部ジャグラー静脈を露出させます。カテーテルに温かい、無菌の生理食塩水を充填します。胸筋を通してカテーテルを貫通し、その後、静脈にカテーテルを挿入します。
針を静かに取り出し、注射器を蛍光トレーサと接続し、カテーテルのデッドボリュームを注入します。カテーテルを安定させるために外科用接着剤を一滴入れる。マウスを慎重に、起こりやすい位置に戻します。
ゆるい髪を取り除きながら、70%エタノールで頭皮をペーパータオルで消毒します。無菌の細かいはさみとピンセットを使用して、頭皮の耳の間に1センチメートルまでの正中線でT字型の切開を行い、カルバリウムを露出させる。頭蓋骨をピンセットで露出させ、ハサミとピンセットを使用してペリオスを慎重に取り除きます。
滅菌綿棒を浸し、生理食塩水を使用して、すべての骨膜および画像を変更する可能性のある破片や髪を取り除きます。頭蓋骨を生理食い物ですすいで血液の痕跡を取り除き、綿棒で骨を急速に乾燥させます。リングに接着剤ジェルを塗布し、リングを露出した骨の上に置き、数秒間維持してリングが頭蓋骨にしっかりと取り付けられるようにします。
スカルを軽く湿らせ、生理布切りの綿棒で湿ら。青色と黄色の成分を1対1の比率で慎重に混合して、シリコンデンタルペーストを準備します。画像撮影時の漏れを防ぐために、歯科用ペーストを塗布してリングを密封します。
リングに入った歯科用ペーストや接着剤は慎重に取り外してください。その後、漏れを確認するために生理音でリングを埋めます。サポートの上にマウスを置き、動物の頭の下に折りたたまれた圧縮を置いて頭を上げ、ホルダーに取り付けたときに頭蓋骨からリングが切り離されるのを防ぎます。
ブロックホルダーのリングをねじ込みます。サポートとマウスアセンブリを加熱された顕微鏡室に置きます。選択した4つの四つ、および放出された光の回復のための適切なレーザーの波長を設定します。
インタージャガーカテーテルを使用して、脈管構造を標識するために、蛍光トレーサーの0.2マイクロモル溶液の50マイクロリットルを注入する。顕微鏡の目的の下に支持およびマウスと顕微鏡の段階を置く。リングが常に生理音で満たされていることを確認し、必要に応じて補充し、目的と生理を浸します。
蛍光を使用して骨髄血管を見つけ、正弦波血管に沿って整列した巨核球を観察します。長い取得のために、8キロのヘルツ共鳴スキャナと双方向モードを使用して384 x 384ピクセルの画像で3D時空の取得を設定します。良好な解像度でライン平均を使用し、最適化されたZステップサイズを選択し、取得を開始する前に必要な時間間隔を設定します。
短時間で迅速に取得するには、空間、時間取得タイプを選択し、画像サイズを最小化します。必要に応じて、撮像場を回転させることで、画像を容器に合わせて調整します。使用可能な最高のスキャン速度と双方向スキャンを使用します。
ライン平均を最小化して、画像定義と取得の迅速性の間の最適な妥協点を見つけます。Z プランを 1 つだけ取得し、取得の時間間隔を最小限に抑えます。血小板速度を測定するためには、取得の10〜20秒で十分であるべきである。
蛍光トレーサーを静脈内投与し、矢印で描かれた流れ方向を有する頭蓋骨骨髄内の吻合骨髄中位症血管を画像化した。蛍光血小板速度を各容器枝に記録し、その変動を観察した。このシヌサイド血管は、流量のリフローやスタシスの存在を伴う、アナストモーゼによる複雑な流れを示す。
矢印は分岐での流れの反対方向を示した。血小板速度はまた、加速、スタシスおよび減速の段階を有する各容器分岐における時間の経過とともに不規則性を示した左および右の容器の枝についても測定した。不規則なマージンを有するプロ血小板を含むプロ血小板の異なる形態が観察され、その後、長いプロ血小板および厚くて短いプロ血小板を含む。
巨核球が複雑な流れの領域でプロ血小板を伸ばしたとき、プロ血小板は流れ方向に応じて一方の容器から他方の容器に球化した。血流を止めると、プロ血小板がリラックスし、マウスが予期せず心停止を起こし、プロ血小板伸びにおける流体力の重要性が示された。プロ血小板の幅と長さも5.2マイクロメートルの平均幅を測定し、約185マイクロメートルの平均最大長を観測した。
時間の関数としてプロメトレットの長さをプロットすると、伸び、スタシス、あるいは引き込みの段階でプロメクレットの挙動を視覚化することができます。1分間に約10マイクロメートルの平均伸び速度が観測された。カテーテルの設置は、プロ血小板形成または関心のある他の事象に対する効果をリアルタイムで研究する薬物の注射を可能にした。
