CMODパックは非常に高精度で細胞をパターン化し、2Dまたは3Dでそれらを培養することができます。これは、細胞細胞相互作用とエンジン新組織の形態形成を研究する機会を開きます.この技術の主な利点は、他のラボが採用するのは簡単で、クリーンルーム、特殊な機器、またはカスタム合成試薬を必要としないということです。
使い捨てピペットを使用して、正のフォトレジストの小さな滴をアルデヒドスライドに落とすことから始めます。スピンコーダーを使用して3000 RPMで30秒間スライドを回転させ、100°Cのホットプレートに1.5分間置いてフォトレジストをクロスリンクします。ホットプレートからスライドを取り外し、スライドの上に目的の機能を備えたフォトマスクを置き、ガラス片で計量し、不透明なボックスでセットアップ全体を覆います。
セットアップをUVランプで2分間露出させ、3~5分間現像液に浸してスライドを開発し、余分な現物溶液を水で洗い流し、空気または窒素の流れの下で乾燥させます。この光を顕微鏡で観察し、フォトリソグラフィの成功を確認し、暗闇の中に保管してください。スライドの各写真パターン領域に20マイクロモルアミン改変オリゴ溶液の液滴を追加し、ピペットチップを使用して、注意を払って、スライドを傷つけないように、DNA溶液が完全に乾燥するまで65°Cのオーブンでスライドを焼き、焼いたスライドと15センチメートルの細胞培養物をフードに置くことによって還元的なアミノ化を行いますシェーカーの。
PBS 40ミリリットルで100ミリグラムの水素化ナトリウムを軽く混ぜ、皿に加えます。その後、シェーカーを15分間オンにします。反応後、このスライドを0.1%のドデシル硫酸ナトリウムで2回洗浄し、未反応のDNAを除去します。
その後、スライドを水で3回洗います。窒素または空気の流れの下にこのスライドを駆動します。最後にアセトンでリンスして残りのフォトレジストを取り除きます。
テキスト原稿に記載されている4マイクロモルユニバーサルアンカーとアダプタソリューションを準備し、PBSで20マイクロモルユニバーサル共同アンカーソリューションを調製します。細胞ペレットを1ミリリットルの氷冷PBSまたは血清フリー培地で再懸濁し、1~300万個の細胞を1.5ミリリットルのミクロ遠心分離管遠心分離機に移します。遠心分離機はGの160倍で4分間行う。
得られた細胞ペレットを75マイクロリットルの氷冷PBSまたは無血清培地に再懸濁し、マイクロモルユニバーサルアンカーおよびアダプタ溶液用に調製した75マイクロリットルを添加する。十分に混ぜ合わせ、氷の上で5分間インキュベートし、ユニバーサル共同アンカー溶液の15マイクロリットルをチューブに加え、十分に混ぜ合わせ、氷の上で5分間サンプルをインキュベートします。細胞懸濁液から余分なオリゴを取り除くために、氷冷PBSまたは血清フリー培地を1ミリリットル加えてチューブに加え、ピペットと混ぜます。
細胞を摂氏4度で4分間160倍Gで遠心分離してペレットし、上清を捨てる。この手順をさらに 2 回繰り返します。氷のコルPBSまたは血清フリー培地中の細胞を再懸濁して、1ミリリットル当たり少なくとも2500万個の細胞の細胞密溶液を作成し、パターンスライドをわずかに傾け、この細胞懸濁液の25マイクロリットルを各フローセルの入口に加える。
出口からPBSおよび1%BSA溶液を取り出し、細胞懸濁液がPDMフローセルを充填することを可能にする。氷の上または室温で30秒間インキュベートし、スライドの出口から細胞懸濁液の5マイクロリットルを吸引し、それを入口に戻します。フローセルごとに 10 回繰り返します。
ピペットPBSまたは血清フリー培地を各フローセルの入口に静かに入れ、余分な細胞を洗い流し、排出口から細胞懸濁液を回収する。スライドに余分なセルが残らないまで、この 2 ~ 4 回繰り返します。3d培養の場合、2%のDNAを含むハイドロゲル前駆体溶液を調製し、その50マイクロリットルを各フローセルの入口に加えます。
流出口から余分な流体を吸引し、ヒドロゲル溶液をフローセル内に駆動させる。37°Cで30〜45分間スライドをインキュベートし、ヒドロゲルをセットし、細胞と表面の間のDNAベースの接着を切断できるようにします。2つのウェルチャンバースライドまたは6つのウェルプレートのウェルに50マイクロリットルのハイドロゲル前駆体を加えます。
各フローセルの両側にPBSのピペット10マイクロリットル。カミソリブレードまたはポイントピンセットを使用してフローセルの全長に沿って配布し、PBSがハイドロゲルの下に突入するようにフローセルの側面を静かに持ち上げます。カミソリのブレードを使用して、スライドを反転してフローセルをスライドの端に移動し、フローセルをスライドから微調整して、カミソリの刃の上に着陸させます。
湾曲した鉗子を使用して、カミソリの刃からフローセルを取り出します。フロー細胞を反転させて、細胞が底部に置き、ハイドロゲル前駆体溶液の液滴の上に置きます。パターン細胞を含むヒドロゲルがヒドロゲル下敷に結合できるように少なくとも30分間インキュベートし、その結果パターン細胞の完全な埋め込みをもたらす。
フローセルを取り出し、完全に媒体に浸します。曲がった鉗子を使って流れセルをそっと動かして、飛び出してメディアに浮かび上がり、捨てます。CMO標識細胞に対するDNAスポット接着の定量化が増加する。
CMO濃度の関数として、3つの実験からの平均および標準偏差として表される。DNAパターンは、異なる濃度のCMOでシアン中のマゼンタおよび接着されたCMO標識細胞に示されている。直線的なDNAパターンに付着したCMO標識ハベックとLMO標識されたハベックの比較をここに示す。
単一のMDCKパターンVSC MODパック、及びメイトルゲルに移され、培養5日後に増殖および偏光することができた。多層多細胞集合体は、無料のCMOで標識された細胞の層を交互に作成した。複数のユニークな細胞集団は、高精度でクロスコンタミネーションなしでパターン化することができます。
このプロトコルを試みるとき、細胞がDNAスポットに固執する機会を最大限に活用するためには、細胞をスライドに加えながら、細胞の密な細胞懸濁液を持つことは重要です。
