ネクロトーシス誘導中の2つの重要なシグナル伝達イベントであるリン酸化RIPK3とMLKLの堅牢な視覚化は、技術的に困難でした。提示されたチラミド増幅プロトコルは、これら2つの分子の高感度検出を可能にする。シグナル増幅ステップは検出閾値を下げ、リン酸化RIPK3およびMLKLの堅牢で再現性のある検出を可能にします。
90, 000個のZBP1発現HT-29細胞を、1センチメートル四方の表面積ウェルプレートに全強度マッコイの5A培地に播種し始め、ハイエンドの顕微鏡観察を可能にします。ウェルあたり200マイクロリットルのエンドボリュームを使用してください。細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素で一晩インキュベートします。
細胞が70〜80%コンフルエントに達したら、単純ヘルペスウイルス1を含む200マイクロリットルの予熱された全強度マッコイの5A培地で細胞に感染し、5の感染の多重度でリム変異体ICP6をコードする。細胞をウイルスと一緒に9時間インキュベートして、ネクロプトーシスを誘発します。ネクロトーシス誘導のポジティブコントロールとして、200マイクロリットルの予熱ネクロプトーシス誘発カクテルで細胞を4時間刺激します。
陰性対照として、摂氏37度に予熱した10マイクロモルのGSK22マイクロリットルGSK3を加えて、RIPK3キナーゼ活性を阻害します。セリン227の自己リン酸化を防ぐために、未処理の状態およびネクロトーシス刺激後にこの阻害剤を含める。細胞を固定するには、培地を取り除き、200マイクロリットルのPBSで細胞を洗浄します。
次にPBSを取り出し、室温で平衡化した150マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドを加えます。細胞を室温で30分間インキュベートします。固定後、4%パラホルムアルデヒドを除去し、200マイクロリットルのPBSで細胞を3回洗浄する。
サンプルは、さらに処理されるまで、摂氏4度で一晩PBSを超えて保存できます。プレートからPBSを取り出し、細胞を100マイクロリットルの透過バッファーとともに室温で傾斜ラボシェーカー上で30分間インキュベートします。インキュベーション後、透過処理バッファーを除去し、100マイクロリットルの洗浄バッファーで細胞を洗浄します。
イメージングチャンバーを洗浄バッファーとともに、傾斜ラボシェーカーで室温で5分間インキュベートします。一次抗体の非特異的結合を防ぐために、プレートを100マイクロリットルのブロッキング媒体とともに室温で2時間、傾斜ラボシェーカーでインキュベートします。次に、ウェルを100マイクロリットルの洗浄バッファーで3回洗浄し、傾斜実験室用シェーカー上で室温で5分間インキュベートします。
洗浄バッファーを除去した後、100マイクロリットルの一次抗体をイメージングチャンバーに加えます。チラミドシグナル増幅の潜在的なバックグラウンドを視覚化し、マスキング閾値を設定するために、一次抗体なし条件を必ず含めてください。チャンバーを摂氏4度で一晩インキュベートします。
一次抗体ミックスを除去し、ウェルを100マイクロリットルの洗浄バッファーで3回洗浄し、傾斜ラボシェーカー上で室温で5分間インキュベートします。洗浄バッファーを除去した後、100マイクロリットルのHRP標識二次抗体と共に細胞をインキュベートし、増幅される一次抗体の種を認識し、傾斜ラボシェーカー上で30分間インキュベートする。抗体インキュベーション中に、ビオチン化チラミドミックスを調製します。
HRPの酵素活性を誘発するには、使用前に新たに酸化基質をTSAバッファーに加えます。次に、最適化された希釈を使用して、調製したTSAバッファーでビオチン化チラミドを希釈します。HRP標識二次抗体でインキュベートした後、ウェルを洗浄バッファーで3回洗浄し、傾斜ラボ用シェーカーで5分間インキュベートします。
ウェルから洗浄バッファーを除去した後、希釈したビオチン-チラミドをウェルに添加して、終末容量を100マイクロリットルにします。室温で10分間傾斜した実験用シェーカーで反応をインキュベートし、続いて洗浄バッファー洗浄を3回行います。二次抗体、結合ストレプトアビジン、核染色剤および洗浄バッファーを含む染色ミックスを調製します。
洗浄バッファーを除去し、プレートを100マイクロリットルの染色ミックスとともに室温で傾斜ラボシェーカーで1時間インキュベートします。このステップ以降、イメージングチャンバーを光から遮蔽してください。染色後、洗浄バッファーで2回連続して洗浄し、ウェルをPBSで2回すすぐ。
PBSを超えるサンプルを摂氏4度で保存し、イメージングまで染色を保持します。これで、イメージングチャンバーを共焦点顕微鏡で視覚化する準備が整いました。チラミドシグナル増幅を含めることで、リム変異型ICP6感染細胞をコードする単純ヘルペスウイルス1の細胞質ゾル中のセリン227でリン酸化されたRIPK3の堅牢な検出が可能になりました。
高感度検出には2%のレーザー出力で十分でした。標準的な間接免疫蛍光法では、より高いレーザー出力はホスホ-RIPK3の検出には不十分でした。3次元Zスタック画像の定量化において、感染細胞は、模擬処理された細胞よりもリン酸化RIPK3陽性のボクセルの約20倍の増加を示した。
模擬処理細胞と比較して野生型単純ヘルペスウイルス1感染細胞のホスホRIPK3染色の増加は、ICP6のリムドメインがセリン227でのRIPK3リン酸化を完全にブロックできないことを示しました。GSK840はRIPK3のキナーゼドメインに結合し、ZBP1活性化時にセリン227でのRIPK3リン酸化を防止し、チラミドシグナル増幅媒介ホスホRIPK3検出法の特異性を確認した。模擬処理した細胞は、セリン358でのMLKLリン酸化のわずかに中断された細胞質染色で低値を示しましたが、感染細胞の細胞質ゾル、核、および原形質膜で強い染色が検出されました。
標準的な間接免疫蛍光法では、感染細胞におけるホスホMLKLシグナルを特異的に検出するために40%のレーザー出力が必要でした。対照的に、チラミド信号増幅はホスホMLKLの検出感度を増加させ、それによって必要なレーザー出力を6%3D Zスタック画像定量に低下させ、チラミドシグナル増幅を使用した場合と比較して、ホスホMLKL陽性のボクセル数が約90倍増加し、標準法を使用した場合と比較して、ホスホMLKLの検出閾値と感度が向上したことを示しています。単純ヘルペスウイルス1と同様に、インフルエンザAウイルス感染はZBP1依存性ネクロプトーシスを引き起こしました。
チラミドシグナル増幅により、ホスホ-RIPK3およびホスホ-MLKLの堅牢な検出が可能になり、ネクロプトーシスを示しました。共焦点染色を解釈するには、いくつかの染色コントロールを含める必要があります。これには、一次状態なし、単一の汚れ、およびポジティブコントロールが必要です。
このプロトコルを適応させることにより、シーケンシャルTSAを使用して複数のターゲットを増幅することができます。これにより、同じ細胞内でリン酸化されたRIPK3とMLKLの検出が可能になります。ネクロトーシスバイオマーカーの高感度検出は、実行されたZBP1依存性細胞死経路がネクロプトーシス、アポトーシス、またはパイロトーシスのいずれかとして確認される必要がある自己炎症またはウイルス感染に関する進行中のZBP1研究にとって洞察に満ちたものです。
