細胞の移動は、治癒創傷の結果を劇的に変えることができる重要な創傷治癒プロセスである。このプロトコルは、研究者が創傷治癒中の細胞移動に対する様々な化合物の影響をよりよく理解することを可能にする。これはしばしば臨床医学のための標的治療戦略につながる可能性があります。
スクラッチアッセイは、費用がかかり、時間のかかるインビボテストの前に有意義な創傷治癒データを生成するための費用対効果の高い、高スループットのアプローチです。方法としてのスクラッチアッセイは、創傷治癒用途に特に関連する。最も具体的には、皮膚。
しかし、アッセイは実際には移行アッセイであり、細胞の移動が測定または捕獲に興味のあるあらゆる細胞タイプに適用することができる。古典的な細胞および組織培養に類似して、標準的な操作手順、訓練、技術、および練習、練習、練習。これらは、スクラッチアッセイで成功するための鍵です。
この手順をデモンストレーションするには、修士課程の学生であるネイサン・クルスと学部研究者のオスカー・ルジャンが行われます。この手順を開始するには、70%イソプロピル水溶液を使用してバイオセーフティIIキャビネットを準備し、衛生ワイプを実行し、背面と側壁から始まり、ベースプレートまで作業します。また、キャビネットに入れる前に、アッセイに使用されるすべての材料を拭き取ってください。
次に、所望の凍結保存細胞株を含むバイアルを得て、解凍するために摂氏37度の深さ1センチメートルの水浴に1つを入れる。T75組織培養フラスコに10%FBSを添加した培地10ミリリットルを加える。セルストックを含むバイアルを開き、溶液を慎重に吸引する。
次に、細胞をT75フラスコに移します。フラスコから1ミリリットルの培地を取り出し、バイアルに戻し、フラスコに戻してバイアルから細胞収率を最大化します。フラスコのキャップを締め、軽く揺らし、表面全体に懸濁液中の細胞を均一に分散させます。
この後、フラスコにここに示す情報をラベル付けし、加湿インキュベーターに摂氏37度、炭酸ガス5%を72時間置きます。まず、培養フラスコをインキュベーターから回収し、テキストプロトコルに概説した接着された細胞を観察する。フラスコから培地の全容を吸引し、それを廃棄物容器に移します。
フラスコに5ミリリットルのバランスのとれた塩溶液を加え、余分な培地、死んだ細胞、または廃棄物をすすぎるように穏やかに揺動かします。その後、フラスコから塩溶液の全容を取り除き、廃容器に捨てます。次に、フラスコにトリプシンを2ミリリットル加え、穏やかに揺らし、接着した細胞の上に酵素を分散させます。
接着面が完全に飽和していることを確認し、2〜3分間インキュベーターに組織フラスコを入れます。この後、フラスコの側面を3~5回軽くタップして、細胞剥離を容易にします。70%アルコールでフラスコを拭き取り、バイオセーフティキャビネットに入れなさい。
5ミリリットルのストックメディアを組織フラスコに加え、酵素基質反応を停止します。フラスコから流体の全容を吸引し、滅菌15ミリリットルの円錐管に移す。200倍gで遠心分離機、摂氏25度で5分間。
その後、70%アルコールを使用してペレット化された細胞を含むチューブを拭き取り、バイオセーフティキャビネットの中に置きます。ピペットは培地から離れ、約250マイクロリットルの液体を細胞ペレットで残した。マイクロ遠心チューブラックのバイアルスロットを横切って円錐チューブの底部を実行して、迅速な振動と妨害を作成し、セルペレットを再中断します。
正しく完了すると、新しいセル溶液は、残りのペレットのない曇りの混合物として表示されます。細胞の再懸濁液に2ミリリットルの培地を加えます。細胞をチューブの側面を20回静かに上下にピペットし、塊を分解します。
そして、セルのサスペンションの総容積を記録します。次に、滅菌ピペットを使用して、96ウェルプレートの空の井戸に20マイクロリットルのトリパンブルーストックを追加します。滅菌ピペットチップを使用して、15ミリリットルチューブからトリパンブルー溶液を含むウェルに細胞ストックの20マイクロリットルを移します。
ピペットを穏やかに混合し、カバースリップとヘモサイトメーター上の計室との間の混合物の10マイクロリットルを移す。中央の四角形と 4 つの角の四角形のセルのみをカウントし、識別された 5 つの四角形のセル総数と生存不可能なセル数の両方を個別に集計します。生存セル数を計算した後、12ウェルプレートの底部に水平線をマークし、イメージング中に基準マークとして機能させます。
培地で細胞ストックを1ミリリットル当たり19,000セルの密度に希釈します。その後、希釈されたセルストックの1ミリリットルで12ウェルプレートの各ウェルを播種し、細胞ストックを定期的に混合して、12のウェル全体で細胞の播種を確実にします。各プレートに、ここに示す情報を付けます。
そして、細胞が100%合流するまで摂氏37度と5%の二酸化炭素で保育器に入れる。インキュベーターから細胞を含む12ウェルプレートを取り出します。10倍の目的を持つ顕微鏡を使用して、細胞を観察し、各ウェル内の合流点を決定します。
次に、各ウェルから成長培地を吸引し、廃棄する。P200ピペッタを1~200マイクロリットルの無菌チップで組み立てます。各井戸で、12:00の位置から6:00の場所まで、細胞表面を横切ってピペットチップを滑空して、スクラッチモック創傷を生成します。
バランスのとれた塩溶液を1ミリリットルずつよく洗い流し、余分な破片や細胞塊を取り除きます。皿を左右に揺らし、洗浄を容易にします。次に、各ウェルからバランスの取れた塩溶液を取り出し、処分する。
1,000マイクロリットルのチップを備えたP1000ピペッタを使用して、調製されたヒ素ストックから1,000マイクロリットルを、処理グループでランダムに割り当てられた井戸に追加します。各井戸に新しいピペットチップを使用し、治療が追加された時間を記録します。5%の二酸化炭素で37°Cでプレートをインキュベートします。
プレートを画像化するには、24時間ごとに4時間ごとに10倍の客観的な倍率で各井戸の画像をキャプチャします。プレートの下部に描画された線分を参照して、各時間ポイントの各ウェル内のスクラッチに沿って同じ位置をイメージします。本研究では、インビボスクラッチ試験アッセイを用いて、ヒ素が細胞移動に及ぼす影響を観察する。
均一な傷は、すべての治療群にわたって観察され、平均スクラッチ幅は約0.8ミリメートルである。コントロール細胞は、20時間後に完全に治癒した傷を示す。2つのヒ素群は、このレベルの治癒を示さない。
10マイクロモル治療で24時間閉鎖を完全に阻害する。これらの結果は、ヒ素の存在が細胞の移動を遅らせることを示している。アッセイ中に撮影された生画像は、自動ソフトウェアを使用して、創傷幅を測定し、閉率を計算し、最後に曲線の下の面積を計算して分析されます。
10マイクロモル治療群は、他のすべての治療群と比較して、ヒト新生児皮膚線維芽細胞の統計的に遅い細胞遊覧を示す。細胞を傷つけるときに一貫性を高めるために、この手法を徹底的に実践することが重要です。アッセイ間の意図しない変動は、データを歪め、結論を変える可能性があります。
定量的ポリメラーゼ連鎖反応や酵素結合免疫吸着アッセイなどの分子技術は、スクラッチ後アッセイを用いて、アッセイで観察される細胞遊離の変化の標的となり得るメッセンジャーシグナルおよびタンパク質を同定することができる。このアッセイは、研究者のがん転移、新しい新興がん治療、幹細胞および再生医療、および他の多くの科学的マイルストーンの理解に貢献しています。
