このプロトコルは、古い技術のための新しい方法を提供し、それは多くの基礎科学研究者のための新しいアプローチを提供します。この技術の主な利点は、費用対効果の高い性質と、より幅広い科学の聴衆が使用する適応性です。移行プレートを準備するには、明るい色の永久マーカーを使用して、48ウェルプレートの各ウェルの背面の中心に線を引き、3つのハッシュマークを描画して各ウェルを3つの別々の領域に分割します。
次いで、1.5〜2回の第4の単通路心臓線維芽細胞を各ウェルに1.5〜2回プレートし、通常の培養条件下で細胞を90〜95%の合流まで24〜48時間培養する。細胞の準備ができたら、各ウェルから上澄み物を取り出し、滅菌P200ピペットチップを使用して、描かれた線に沿って1つのパススクラッチを作ります。低血清培地でウェルをすすい、未接続の心臓線維芽細胞を除去し、各ウェルに低血清培地の500マイクロリットルを加えます。
薬理学的薬剤が使用されている場合は、適切なウェルに薬剤を追加します。次に、20倍の目的を持つ反転顕微鏡を使用して、マーキングを使用して1ウェルあたり2つのゼロ時間画像をキャプチャし、各ウェルを配置して、傷ついたラインの上半分のイメージングを可能にします。次に、プレートを移動して、スクラッチラインの下半分を視野に入れて、2番目の画像を収集し、プレートを細胞培養インキュベーターに24時間置きます。
インキュベーションの最後に、非滅菌PVSで各井戸をよく洗い、ヒュームフードの各ウェルに4%パラホルムアルデヒドの500マイクロリットルを加えます。室温で10分後、新鮮なPBSで1回5分間よく洗います。最後の洗浄後、ウェルあたり300マイクロリットルの透過液で細胞を透過させ、室温で30分間穏やかな揺れにします。
インキュベーションの終了時に、透過液を1%クマシブリリアントブルーステインに交換し、室温で穏やかな揺れで10分間インキュベーションします。続いてPBSで3分、5分のロッキングで1回、5分間の打ち込み。最後の洗浄の後、各井戸にPBSの300マイクロリットルを追加し、慎重に同様に実証された1つ2つの24時間の画像をキャプチャする前に、ゼロ時間画像と同じ位置にプレートを配置します。
実験の最後に、画像と適切なイメージング解析ソフトウェアプログラムを開き、ゼロ時間画像上に新しいレイヤーを作成します。ダブルクリックして、新しいレイヤーラインレイヤーの名前を変更し、ブラシツールを選択します。ピクセル サイズを 10 に変更し、色を赤に変更し、2 つの別々の線を描画して、スクラッチの輪郭を描きます。
線はどのセルにも接してはなりません。イメージングソフトウェアで24時間画像を開き、移動ツールを選択します。コントロールボタンを押したまま、線と背景の両方のレイヤーをクリックし、ゼロ時間画像の中央をクリックし、両方のレイヤーを24時間画像の中央にドラッグします。
24 時間の画像で、ゼロ時間の背景レイヤーをクリックし、不透明度を 50% 押下コントロール ボタンに変更し、ゼロ時間の背景レイヤーとライン レイヤーの両方をクリックし、[編集] をクリックして自由な変換を行い、自由な変換を使用してレイヤーを自由に変換し、ゼロ時間の背景とライン イメージを 24 時間の背景画像に合わせて、領域移動線が 24 時間の画像に正しく配置されるようにします。線レイヤーが正常に重ね合されたら、右クリックしてゼロ時間背景レイヤーを削除します。残りのライン レイヤーを使用して、スクラッチ領域に 24 時間にわたって移動したセルの数を決定できます。
次に、新しい移行イメージを Photoshop ファイルと TIFF ファイルまたは JPEG ファイルの両方として保存します。移動するセルの数を定量化するには、移行イメージと TIFF ファイルまたは JPEG ファイルを受け入れるプログラムを開き、その間に配置されているセルの数を手動でカウントし、各ウェルの両方のイメージの 2 つの赤い線に触れます。次に、イメージごとの移動セルの数を記録します。
移行の領域を確認するには、イメージング ソフトウェアで移行の行を含む 24 時間イメージを開き、イメージを移行領域イメージとして保存します。保存後、背景レイヤーをクリックし、右クリックしてレイヤーを削除します。ブラシ ツールを使用して、線分に使用したのと同じ色で、画像、モード、およびグレー スケールをクリックしてイメージを白黒に変更する、スクラッチ ライン間の領域を塗りつぶします。
イメージを保存し、マイグレーションエリアイメージと適切な画像解析ソフトウェアプログラムを開きます。[編集] をクリックし、反転します。移行行の領域を決定するには、[イメージ]、[調整]、[しきい値] の順にクリックします。
黒の移行領域が赤になり、パーセント領域がしきい値ボックスに表示されます。次に、移行ラインのパーセント領域を記録し、この値が同じイメージの移動セルの数とペアであることを確認します。この分析では、非糖尿病心から46の線維芽細胞と糖尿病心からの129の線維芽細胞が24時間の実験期間中に移行した。
マイグレーション領域の測定は実証したように、測定された全面積の24.78%を非糖尿病スクラッチ領域が占めているのに対し、糖尿病移動スクラッチ領域は測定面積全体の16.77%を占めていることが明らかになった。移行領域に正規化することで、細胞移動をより適切かつ厳格に評価し、潜在的な人為的ミスを否定できます。例えば、移行した線維芽細胞の数のみを比較した場合、この分析では、このウェルで移動した細胞の数が第2ウェルの移行した細胞の2倍であったことが示されます。
しかし、データを正規化するためにスクラッチ領域を使用した場合、移行領域に対する線維芽細胞の比率は、両方のウェルでほぼ同じであることが観察された。ゼロ時間イメージでキャプチャした 24 時間イメージでは、移行の領域を再キャプチャしてください。この手順に従って、免疫体細胞化学を行い、細胞内のタンパク質発現を調べることができる。
私たちは、スクラッチ移行アッセイに対するこの新しいアプローチは、以前は利用できなかった科学研究のより多くの道を開くことを可能にすると信じています。
