このインビトロ暴露システムを用いて、ALIで培養されたヒト肺細胞を曝露することにより、急性肺細胞傷害に関する空気中粒子のスクリーニングは、動物実験を減らすのに役立つ。この露出システムの主な利点は、均質な分布と細胞上の粒子の位置につながる放射状エアロゾル分布の概念です。細胞を播種する前に、6つのウェルプレートの各ウェルに2.5ミリリットルの強化成長培地を加えます。
細胞を含まない細胞培養液を慎重にウェルの中に入れ、細胞培養インサートごとに1ミリリットルの増殖培地を加える。30分間、摂氏37度、炭酸ガス5%でプレートをインキュベートします。細胞のトリプシン化後、10ミリリットルの等張溶液を充填したカップに細胞培養懸濁液の100マイクロリットルを希釈する。
カップを揺らさずにゆっくりと傾けます。セルカウンターで、A549細胞の細胞特異的測定パラメータに基づいて、ミリリットル当たりの生存細胞数と細胞生存率を決定します。プレートの焼戻し後、細胞培養インサート内の培地を吸引し、各細胞培養インサートの1ミリリットル当たり5番目の細胞に3倍の密度でA549細胞の1ミリリットルをシードする。
穏やかな揺れによって細胞懸濁液を分配し、24時間インキュベートする。プレスの前面の時間制御を介してプレス時間を設定します。圧縮空気バルブで圧縮空気供給を開きます。
プレスの前面に圧力調整器を使用して、圧縮空気圧を約2つのバーに設定します。引き出しを引き出し、押しボタンを押して、デジタル圧力スイッチの押圧を読み取ります。少量の被検物質で物質容器を充填します。
プランジャーを物質容器に入れ、少し前後に回して粉末を均等に分配します。物質容器をプランジャー付きで引き出しに入れ、プレスボタンを押します。ドロワーを開け、プランジャを取り外します。
重要なステップは、安定した微粒子暴露を可能にするために、物質容器内の粉末ケーキに特異的に圧縮しなければならない試験物質のプレスです。エアロゾル誘導モジュールから入口アダプターとコンデンセートリフレクターを取り外します。エアロゾル誘導モジュールの3つのエアロゾル給電孔を、プラグ付きのプラグと、サンプリングモジュールの中程度の供給接続をダミーフラップで閉じます。
エアロゾル誘導モジュールのチューブコネクタに真空ラインを接続します。ハンドホイールを使用してモジュールを閉じ、フローコントローラの値を測定します。閉店の数分後、値は毎分5ミリリットル以下に減少します。
エアロゾルジェネレータソフトウェアを起動します。物質スクレーパーが最も低い位置にない場合は、ボタンホーミングモードを押します。プレス試験物質を持つ物質容器を、物質スクレーパーの上に逆さまに置きます。
物質容器のガラスが前面に向かっていることを確認します。スロットにロックプレートを置き、黒いネジを締めます。[フィード] と [回転] の値を目的の設定に変更します。
下向き矢印を使用して、物質スクレーパーが押された物質の近くまで、物質容器でスライドを押し下げます。マスフローコントローラをタップしてエアロゾル発電機への圧縮空気供給を開き、スタートボタンをクリックしてエアロゾルの生成を開始します。長時間の待ち時間を避けるため、フィードレートを1時間あたり15~20ミリメートルに設定します。
溶出器のガラス管の後ろから下から位置する小さな懐中電灯で、微細な塵雲を観察することにより、正しい粒子生成を制御します。事前に加熱された露出媒体で媒体供給を開始し、モジュールが開いている間にダウンパイプが覆われるまでサンプリングモジュールを充填します。露光モジュールにブラインド細胞培養挿入物を挿入し、ダウンパイプが媒体で覆われ、挿入物の下側が媒体に接触するまで露光媒体をポンプダウンさせる。
エアロゾル発生器を起動し、露出モジュールを閉じて、露出モジュールをエアロゾル発電機の露出モジュール出口に接続します。リードタイムの30分後、溶出器の露光モジュール出口をゴムプラグで密封し、ブラインドインサートを取り外します。ダウンパイプが媒体で覆われるまで、露出媒体を補充します。
ピンセットの助けを借りて、6つのウェルプレートから細胞培養インサートを取り除きます。細胞培養液から慎重に成長培地を注ぎ、挿入物を倒してピペットを使用して吸気し、残留液を捨てます。露出およびきれいな空気モジュールの両方の露出室に挿入物を置く。
モジュールを閉じ、エアロゾル発生器の露光モジュール出口とクリーンエアモジュールを同時にキャリアガス供給に接続して、露光実験を開始します。実験が完了したら、露出モジュールとクリーンエアモジュールを取り外し、露出モジュールの出口を密封します。停止ボタンをクリックして、圧縮空気供給とエアロゾル発電機を停止します。
露出およびきれいな空気モジュールを開き、準備されたポストインキュベーション6ウェルプレートに細胞培養インサートを移すためにピンセットを使用する。6つのウェルプレートと未露出細胞培養インサートを、摂氏37度で24時間、空気液体界面で5%の二酸化炭素をインキュベートします。露光後24時間、新たに調製した6枚のウェルプレートに細胞培養インサートを挿入する。
新鮮な調製されたWST1溶液を各細胞培養挿入物に1ミリリットル添加する。溶液を均一に細胞に分配するためにプレートを慎重に揺らします。セル培養インサートを6つのウェルプレートに37°C、炭酸ガス5%で1時間インキュベートします。
その後、上清の100マイクロリットルを各6つのウェルプレートから96ウェルプレートに三重に移します。マイクロプレートリーダーを使用して、参照波長650ナノメートルの450ナノメートルで吸光度を測定します。CULTEX RFSは空気液体のインターフェイスで空気粒子への細胞の直接および同種の露出を可能にする特別に設計されたモジュラーのインビトロ露出システムである。
きれいな空気への細胞の暴露は、時間の経過とともに細胞の生存率の低下を招かなくなります。この暴露システムは、試験化合物の急性吸入危険の予測モデルとして正常に検証され、確立された。A549細胞の異なる試験物質への暴露は、無、中、または強い毒性を示した。
インキュベーション時間、粒子生成のリードタイム、粒子状堆積時間の時間枠を厳密に保つようにしてください。この露光法は、主に細胞の粒子暴露のために設計されているが、エアロゾルの生成方法を適応させることによって液体エアロゾルおよびガスの暴露に拡張することができる。このスクリーニング方法により、インビトロにおける急性吸入毒性に関する吸入可能粒子の定性的評価が可能となり、通常はこの毒物学的評価を提供する動物実験を低減する。
有毒な試験物質を使用することは非常に危険であり、手袋、マスクを着用するなどの予防措置は、常にそのような化合物を取り扱う際に取られるべきであることを忘れないでください。
