有望で新しい遺伝子治療アプローチの効率と安全性を評価するためには、検証済みの前臨床インビボモデルにおける遺伝子改変細胞の包括的な試験が重要です。関連する細胞表面マーカーの試薬の交差反応性の保全、および非ヒト霊長類モデルに沿って患者に投与される同じ支持的な治療法を適用して臨床パラメータを密接に模倣する能力。私と一緒に手順を実証することは、ハンス・ピーター・キエム博士の研究室の研究技術者であるアナイ・ペレスです。
健康な非ヒト霊長類ドナーから50ミリリットルの円錐形チューブに分離された骨髄の10〜12ミリリットルのアリコートを加えることで始めます。チューブの体積を50ミリリットルまで、浸透液で持ち込み、室温で最大7分間培養します。遠心分離によって細胞の破片を取り除き、上清の最後の2〜5ミリリットルを除いてすべてを吸引する。
チューブをフリックして残留上清体積中のペレットを再懸濁し、骨髄懸濁液を70マイクロメートルの孔細胞ストレーナーを使用して新しい50ミリリットルチューブに移し、血栓を除去します。新鮮な血分解バッファーを追加して体積を最大 50 ミリリットルにし、遠心分離によって収集する前に室温でさらに 5 分間細胞をインキュベートします。上清のすべてを吸引し、最大バッファーの10ミリリットルで細胞を再懸濁します。
別の70マイクロメートルの細孔ストレーナーを通して細胞懸濁液をろ過する前に、新鮮なバッファーの40ミリリットルでチューブをすすいで、細胞懸濁液で洗浄をプールします。標準的な磁気補助細胞選別プロトコルに従ってCD34陽性細胞を濃縮した後、ビード単離された細胞を最大50ミリリットルの新鮮な最大バッファーで洗浄し、HSPC培地中のペレットを再懸濁します。その後、培養した細胞の10〜20ミリリットルをベント組織にプレートし、T75フラスコを摂氏37度および5%の二酸化炭素インキュベーターで一晩培養処理した。
骨髄の細胞サンプルの前および後の濃縮純度を評価するために、すべての事象散乱、CD34陽性、造血幹細胞、多能アンエリスロ骨髄性前駆細胞およびリンパ球骨髄性前駆腫の全てのゲートを示す適切なプロットおよび集団階層を有するフローサイトメトリープロトコルを作成する。次に、未染色の、前濃縮、白血球サンプルを実行して、前方および側面散乱パラメータの電圧を調整し、すべての蛍光チャネルに続いて単一の染色補償ビーズを使用して隣接するチャネル間の補償を調整する。次に、CD34濃縮効率を文書化するために調整および補償されたプロトコルで、残りの染色されていないサンプルおよび染色されたサンプルをすべて実行する。
全ての補正が設定されている場合、CD34サブセットの並べ替え精製のための細胞ソーターをコロニー形成細胞アッセイに構成し、染色されたCD34濃縮サンプルチューブをサイトメーターにロードする。その後、2000 から 3000 のイベントを記録し、信号強度と目標集団に合わせてソート ゲートを微調整します。セットアップが完了すると、流量を毎秒500〜1000細胞に調整し、散乱から800〜1200細胞を選別し、CD34陽性、造血幹細胞、多能性のアンエリスロ骨髄前駆腫およびリンパ球骨髄前駆ゲートを1つのコロニー1個のチューブを含む別々のチューブに入れる。
コレクションチューブのボルテックスの最後に、3つの無菌3.5センチメートルに1ミリリットルの細胞懸濁液を加え、非組織培養は、37°Cで10〜14日間のインキュベーションのために細胞集団あたり個々の15センチメートルのシャーレ内に設定されたペトリ皿を処理した。翌朝、10ミリリットルのピペットを使用して、各フラスコの底部からステキンドセルを滅菌HBSSで静かにすすいで、遠心分離によって採取した細胞を回収する。1x10で細胞を1x10から6番目の細胞に再懸濁します。
そして、組み換えフィブロネクチンフラグメントの1ウェルにモックコントロール用の1ミリリットルの細胞を追加し、細胞培養インキュベーターで一晩インキュベーションするために12ウェルプレートをコーティングした。次に、残りの細胞の10ミリリットルのアリコートを組換えフィブロネクチンフラグメントに加え、T75フラスコをコーティングし、キャップをベントして細胞培養インキュベーターに30分間インキュベートする。インキュベーション解凍ウイルスコンディション培地サンプルの間に、価およびミリリットル当たりの感染性単位数に基づいて、添加するウイルスの量を計算する。
培養器からフラスコを取り出し、各フラスコに適切な量のウイルス調節培地を加えてから、細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%に戻します。翌朝、フラスコから細胞を個々の50ミリリットル円錐形チューブに移す。1回の洗浄で最大50ミリリットルのHBSSで細胞を洗浄し、このステップを最大3回繰り返して残留ウイルスを除去します。
プロスタグランジンE2を補ったHSPC培地で細胞を2時間インキュベートする。その後、細胞を洗浄し、チューブあたり2%の自己血清を補ったHBSSの10ミリリットルで細胞を再懸濁します。その後、16.5ゲージ針を装備した20ミリリットルの注射器を使用して細胞懸濁液を吸引する。新鮮なHBSSプラス2%の自己血清でチューブの内側を洗浄し、注射器に吸引します。
自己宿主に注入するまで氷の上に細胞溶液を置く前に、慎重に針キャップで注射器をキャップします。トランスデューセドされた細胞の遺伝子改変効率を決定するために、プレート1 x 10をHSPC培地のミリリットル当たり1ミリリットル当たり予約mockまたはトランスデュースした細胞を非組織培養処理プレートに投与した。2日目、5日目、12日目の転写後、細胞を収穫して数えます。
2日目と5日目に、新鮮なHSPC培地中の細胞の33%を1x10から6ミリリットルの濃度で再プレートする。2日目、5日目、12日目に、定量的リアルタイムPCR用のDNA抽出バッファー内の細胞の33%を凍結し、標準的なプロトコルに従ってフローサイトメトリーによって細胞の最終33%を分析し、造血原生の表向き組成を評価する。流量サイトメトリーによってトランスジーン発現を定量化するには、3つの側面散乱対を追加する。
トランスジーンプロット;とゲート造血幹細胞上の最初のプロット、多能性アンエリスロ骨髄性前駆腫の第2のプロット、およびリンパ筋骨髄性前駆体の第3のプロット、すべて対トランスジーン。その後、2000~3000のイベントを記録し、信号強度と目標集団に合わせてソートゲートを細かく調整します。
このプロトコルを用いて、富化された非ヒト霊長類CD34陽性HSPCの数は、典型的には、入力総白血球数に比例する。これまでの知見によると、CD34陽性HSPC製品の合計には、真の長期および移植造血幹細胞ではない細胞が含まれていることが示されているように、これらのフローサイトメトリーベースおよびコロニー形成細胞技術は、長期間の造血幹細胞に富んだサブセットを確実に同定し、分化するために使用することができる。CD34陽性ヒト幹細胞濃縮細胞は、レンチウイルスベクターを用いて効率よく遺伝子改変することができる。
12日間の液体培養アッセイ期間にわたって希釈されたベクターの非統合コピーを運ぶ細胞は、ゲノム中の安定的に統合されたベクターが子孫のすべてに渡される。コロニー形成細胞アッセイにおけるベクターの発現によって確認された。この前臨床方法は、遺伝子治療のための品質管理された非ヒト霊長類造血幹細胞および前駆細胞で遺伝子組み換え遺伝子組み換えに使用することができる。
この方法は、他の種、造血幹細胞および前駆細胞の供給源、遺伝子治療ツールおよび疾患に容易に適応することができる。この徹底的に吟揚されたプロトコルは、多数のヒト疾患に対する効果的な治療法のモデリングに大きな約束を示しています。非ヒト霊長類組織で作業するには、個人用保護具を含む強化されたセキュリティ対策が必要です。
