Pour évaluer l’efficacité et l’innocuité d’approches prometteuses et novatrices en thérapie génique, l’essai complet des cellules génétiquement modifiées dans les modèles in vivo précliniques validés est crucial. La conservation de la réactivité croisée des réaccente des marqueurs de surface cellulaire pertinente et la capacité d’appliquer les mêmes traitements de soutien administrés aux patients selon des modèles de primates non humains pour imiter étroitement les paramètres cliniques. Anai Perez, technicienne de recherche au laboratoire du Dr Hans-Peter Kiem, fera la démonstration de la procédure avec moi.
Commencez par ajouter des aliquots de 10 à 12 millilitres de moelle osseuse isolés d’un donneur sain de primates non humains en tubes coniques de 50 millilitres. Porter le volume du tube jusqu’à 50 millilitres avec tampon hémolytique et incuber les cellules jusqu’à sept minutes à température ambiante. Enlever les débris cellulaires par centrifugation, et aspirer tous sauf les deux à cinq derniers millilitres du supernatant.
Resuspendez la pastille dans le volume résiduel du supernatant en faisant glisser le tube et transférez les suspensions de moelle osseuse dans un nouveau tube de 50 millilitres à l’aide d’une passoire à cellules poreuses de 70 micromètres pour enlever les caillots sanguins. Ajouter un tampon hémolytique frais pour porter le volume jusqu’à 50 millilitres et incuber les cellules pendant encore cinq minutes à température ambiante avant leur collecte par centrifugation. Aspirer tous les supernatants et résusquer les cellules en 10 millilitres de tampon max.
Avant de filtrer la suspension cellulaire à travers une autre passoire pore de 70 micromètres, rincer le tube avec 40 millilitres de tampon frais, et mettre le lavage en commun avec la suspension cellulaire. Après l’enrichissement des cellules positives CD34 selon les protocoles standard de tri des cellules magnétiques assistées, lavez les cellules isolées de perles dans jusqu’à 50 millilitres de tampon maximum frais et réutilisez la pastille dans le milieu HSPC. Puis plaque 10 à 20 millilitres des cellules dans les tissus ventilés cultivés traités flacons T75 pour leur culture du jour au lendemain dans un incubateur de 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Pour évaluer la pureté avant et après l’enrichissement des échantillons cellulaires de la moelle osseuse créer un protocole de cytométrie de flux avec les parcelles appropriées et la hiérarchie de la population montrant toutes les portes pour tous les événements se disperser, CD34 positif, cellules souches hématopoïétiques, multipotents an-érythro progéniteurs myéloïdes et progéniteurs lympho myéloïdes. Ensuite, exécutez un échantillon de globules blancs non tachés, pré-enrichissement, pour ajuster les tensions pour les paramètres de dispersion avant et latérale, et tous les canaux de fluorescence suivis de perles de compensation tachées unique pour ajuster la compensation entre les canaux adjacents. Ensuite, exécutez tous les échantillons non tachés et tachés restants avec le protocole ajusté et compensé pour documenter l’efficacité d’enrichissement du CD34.
Lorsque toutes les compensations ont été réglées configurer le trieur cellulaire pour la purification tri des sous-ensembles CD34 en colonies formant des analyses cellulaires, et charger le tube d’échantillon enrichi CD34 taché sur le cytomètre. Puis enregistrer 2000 à 3000 événements, et amende ajuster les portes de tri pour s’adapter à la force du signal et les populations cibles. Lorsque la configuration est terminée acquérir les cellules ajustant le débit à 500 à 1000 cellules par seconde, et le tri de 800 à 1200 cellules de la dispersion, CD34 positif, cellule souche hématopoïétique, multipotente an-érythro progéniteur myéloïde et lympho myéloïde portes progénitrices dans des tubes distincts contenant 3,6 millilitres de colonie formant milieu cellulaire par tube.
À la fin de la sorte vortex les tubes de collecte, et ajouter un millilitre de suspension cellulaire à trois stériles 3,5 centimètres, la culture non tissulaire traité boîtes de Pétri mis dans les boîtes de Pétri individuels de 15 centimètres par population cellulaire pour leur incubation de 10-14 jours à 37 degrés Celsius. Le lendemain matin, utilisez une pipette de 10 millilitres pour rincer doucement les cellules adhérentes du fond de chaque flacon avec du HBSS stérile, et recueillir les cellules récoltées par centrifugation. Resuspendez les cellules dans le milieu de transduction à une concentration de 1 x 10 à la 6ème cellules par millilitre de concentration.
Et ajouter un millilitre de cellules pour le contrôle simulé dans un puits d’un fragment recombinant de fibronectine enduit de 12 plaques de puits pour une incubation nocturne dans l’incubateur de culture cellulaire. Ajouter ensuite 10 millilitres aliquots des cellules restantes dans des flacons T75 recouverts de fragments de fibronectine recombinants pour une incubation de 30 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire avec les bouchons ventilés. Pendant le dégel d’incubation, le virus a conditionné des échantillons moyens et calculé la quantité de virus à ajouter en fonction du titer et du nombre d’unités infectieuses de cellules par millilitre.
Sortez le flacon de l’incubateur et ajoutez le volume approprié de milieu conditionné par le virus à chaque flacon avant de retourner les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain matin, transférez les cellules du flacon en tubes coniques individuels de 50 millilitres. Lavez les cellules jusqu’à 50 millilitres de HBSS par lavage, et répétez cette étape jusqu’à trois fois pour éliminer le virus résiduel.
Incuber les cellules pendant deux heures dans les médias HSPC complétés par la prostaglandine E2. Ensuite, lavez les cellules et résuspendez les cellules en 10 millilitres de HBSS complétés par 2% de sérum autologue par tube. Aspirez ensuite les suspensions cellulaires à l’aide d’une seringue de 20 millilitres munie d’une aiguille de calibre 16,5. Laver l’intérieur du tube avec du HBSS frais plus 2% sérum autologue, et aspirer dans la seringue.
Capuchonez soigneusement la seringue avec le bouchon d’aiguille avant de placer la solution cellulaire sur la glace jusqu’à son infusion dans un hôte autologue. Pour déterminer l’efficacité de modification génétique des cellules transduced, plaque 1 x 10 à la 6ème cellule réservée de maquette ou de transduced par millilitre de milieu de HSPC sur des plaques traitées de culture non tissulaire. Les jours deux, cinq et douze après la transduction, récoltez et comptez les cellules.
Les jours deux et cinq, replatez 33% des cellules dans le milieu frais de HSPC à une concentration fraîche de 1 x 10 à 6ème par millilitre. Les jours deux, cinq et douze, congelez 33% des cellules dans le tampon d’extraction d’ADN pour le PCR quantitatif en temps réel, et analysez les 33% finaux des cellules par cytométrie de flux selon les protocoles standard pour évaluer la composition phénotypique de la descendance hématopoïétique. Pour quantifier l’expression transgénique par cytométrie d’écoulement, ajoutez trois scatters latérables supplémentaires par rapport à.
parcelles transgéniques;et porte la première parcelle sur les cellules souches hématopoïétiques, la deuxième parcelle sur les progéniteurs myéloïdes multipotents an-érythro, et la troisième parcelle sur les progéniteurs myéloïdes lymphoïdes, tous contre le transgène. Enregistrez ensuite de 2000 à 3000 événements et ajustez finement les portes de tri pour s’adapter à la force du signal et aux populations cibles.
En utilisant ce protocole, le nombre de PRIMATES NON humains CD34 positifs HSPC qui sont enrichis est généralement proportionnelle à l’entrée totale des globules blancs. Comme les résultats précédents ont démontré que le produit HSPC positif de CD34 total inclut des cellules qui ne sont pas vraies à long terme et greffent des cellules souches hématopoïétiques, ces techniques de cellules basées sur la cytométrie de flux et de formation de colonie peuvent être employées pour identifier et différencier de manière fiable des sous-ensembles enrichis pour les cellules souches hématopoïétiques à long terme des progéniteurs engagés. Les cellules souches humaines positives CD34 peuvent être modifiées efficacement à l’aide de vecteurs lentiviraux.
Les cellules portant une copie non intégrée du vecteur se diluent au cours de la période d’analyse de la culture liquide de 12 jours, tandis que les vecteurs fortement intégrés dans le génome sont transmis à l’ensemble de la descendance. Comme le confirme l’expression du vecteur dans la colonie formant des analyses cellulaires. Cette méthode préclinique peut être utilisée pour isoler génétiquement modifié dans la qualité contrôlée primate non humain hématopoïétique cellules souches et progénitrices pour la thérapie génique.
Cette méthode peut être facilement adaptée à d’autres espèces, sources de cellules hématopoïétiques souches et progénitrices, outils de thérapie génique et maladies. Ce protocole soigneusement examiné montre une grande promesse pour la modélisation des thérapies efficaces pour de nombreuses maladies humaines. Gardez à l’esprit que le travail avec les tissus primates non humains nécessite des mesures de sécurité renforcées, y compris l’équipement de protection individuelle.
