Para avaliar a eficiência e a segurança de abordagens promissoras e novas de terapia genética, o teste abrangente de células modificadas por genes em modelos in vivo pré-clínicos validados é crucial. A conservação da reatividade cruzada dos marcadores de superfície celular relevantes dos reagentes e a capacidade de aplicar os mesmos tratamentos de suporte administrados aos pacientes ao longo de modelos de primatas não humanos para imitar de perto parâmetros clínicos. Demonstrando o procedimento comigo estará Anai Perez, um técnico de pesquisa do laboratório do Dr. Hans-Peter Kiem.
Comece adicionando alíquotas de 10 a 12 mililitros de medula óssea isoladas de um saudável doador de primatas não humanos em tubos cônicos de 50 mililitros. Leve o volume do tubo até 50 mililitros com tampão hemollítico e incuba as células por até sete minutos em temperatura ambiente. Remova os detritos celulares por centrifugação, e aspire todos, exceto os últimos dois a cinco mililitros do supernatante.
Resuspenque a pelota no volume de supernacante residual movendo o tubo, e transfira as suspensões da medula óssea para um novo tubo de 50 mililitros usando um coador de células porosas de 70 micrômetros para remover quaisquer coágulos sanguíneos. Adicione um tampão hemollítico fresco para trazer o volume até 50 mililitros, e incubar as células por mais cinco minutos à temperatura ambiente antes de sua coleta por centrifugação. Aspire todos os supernascentes e resuspense as células em 10 mililitros de tampão máximo.
Antes de filtrar a suspensão da célula através de outro filtro de poros de 70 micrômetros, enxágue o tubo com 40 mililitros de tampão fresco e acumule a lavagem com a suspensão da célula. Depois de enriquecer para células positivas CD34 de acordo com protocolos padrão de classificação celular assistido magnético, lave as células isoladas de contas em até 50 mililitros de tampão máximo fresco, e resuspenda a pelota no meio HSPC. Em seguida, a placa de 10 a 20 mililitros das células em tecido ventilado cultivados tratados frascos T75 para sua cultura durante a noite em uma incubadora de 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono.
Para avaliar a pureza pré e pós-enriquecimento das amostras celulares da medula óssea criam um protocolo de citometria de fluxo com as parcelas apropriadas e a hierarquia populacional mostrando todos os portões para todos os eventos dispersos, células-tronco bamopoiéticas, progenitoras multipotentes an-eritróidas e progenitores mieloides linfo. Em seguida, execute uma amostra de células brancas não manchadas, pré-enriquecimento para ajustar as tensões para os parâmetros de dispersão dianteira e lateral, e todos os canais de fluorescência seguidos de contas de compensação manchada única para ajustar a compensação entre os canais adjacentes. Em seguida, execute todas as amostras restantes não manchadas e manchadas com o protocolo ajustado e compensado para documentar a eficiência de enriquecimento do CD34.
Quando todas as compensações tiverem sido definidas, configure o classificador de células para a purificação do tipo de subconjuntos CD34 em ensaios celulares formadores de colônias, e carregue o tubo de amostra enriquecido CD34 manchado no cítmetro. Em seguida, registos de 2000 a 3000 eventos, e ajuste bem os portões de classificação para se adequar à força do sinal e atingir populações. Quando a configuração estiver completa, a aquisição das células ajustando a taxa de fluxo para 500 a 1000 células por segundo, e classificação de 800 a 1200 células da dispersão, célula-tronco baterótica, hematopoiética, progenitora multipotente an-eritróida e progenitor mieloide linfo em tubos separados contendo 3,6 mililitros de colônia formando meio celular por tubo.
No final do tipo vórtice os tubos de coleta, e adicionar um mililitro de suspensão celular a três estéreis 3,5 centímetros, cultura não-tecido tratada placas de petri definidas dentro de placas de petri individuais de 15 centímetros por população celular para sua incubação de 10-14 dias a 37 graus celsius. Na manhã seguinte, use uma pipeta de 10 mililitros para enxaguar suavemente as células aderentes do fundo de cada frasco com HBSS estéril, e coletar as células colhidas por centrifugação. Resuspend as células em meio de transdução em uma 1 x 10 para a 6ª células por concentração mililitro.
E adicione um mililitro de células para o controle simulado em um poço de um fragmento de fibronectina recombinante revestido 12 placas de poço para uma incubação durante a noite na incubadora de cultura celular. Em seguida, adicione 10 alíquotas mililitros das células restantes em fragmento de fibronectina recombinante revestido frascos T75 para uma incubação de 30 minutos na incubadora de cultura celular com as tampas ventiladas. Durante a incubação, o vírus condigentou amostras médias e calculou a quantidade de vírus a ser adicionada com base no título e no número de unidades infecciosas de células por mililitro.
Tire o frasco da incubadora e adicione o volume adequado de vírus condicionado a cada frasco antes de devolver as células a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono. Na manhã seguinte, transfira as células do frasco para tubos cônicos individuais de 50 mililitros. Lave as células em até 50 mililitros de HBSS por lavagem, e repita este passo até três vezes para remover o vírus residual.
Incubar as células por duas horas em mídia HSPC complementada com prostaglandina E2. Em seguida, lave as células e resuspenja as células em 10 mililitros de HBSS suplementados com soro 2% autólogo por tubo. Em seguida, aspire as suspensões celulares usando uma seringa de 20 mililitros equipada com uma agulha calibre 16,5. Lave o interior do tubo com HBSS fresco mais soro 2% autólogo e aspire na seringa.
Corte cuidadosamente a seringa com a tampa da agulha antes de colocar a solução celular no gelo até sua infusão em um hospedeiro autólogo. Para determinar a eficiência de modificação genética das células transduzidas, a placa 1 x 10 até a 6ª células simuladas ou transduzidas reservadas por mililitro de meio HSPC em placas tratadas de cultura não-tecidual. Nos dias dois, cinco e doze pós-transdução, colher e contar as células.
Nos dias dois e cinco, repata 33% das células em meio HSPC fresco em uma concentração de 1 x 10 para o 6º por mililitro. Nos dias dois, cinco e doze, congele 33% das células no tampão de extração de DNA para PCR quantitativo em tempo real, e analise os 33% finais das células por citometria de fluxo de acordo com protocolos padrão para avaliar a composição fenotípica da prole hematopoiética. Para quantificar a expressão transgênica por citometria de fluxo, adicione três dispersão lateral adicional vs.
transgene plots;and gate the first plot on the hematopoietic stem cells, the second plot on the multipotent an-erythro myeloid progenitors, e o terceiro enredo sobre os progenitores mieloides linfo, todos vs. o transgene. Em seguida, registos de 2000 a 3000 eventos e ajuste bem os portões de classificação para se adequar à força do sinal e atingir populações.
Usando este protocolo, o número de HSPC positivos de primatas não humanos que são enriquecidos é tipicamente proporcional à contagem total de glóbulos brancos de entrada. Como os achados anteriores demonstraram que o produto HSPC positivo cd34 total inclui células que não são verdadeiras a longo prazo e enxertam células-tronco hematopoiéticas, essas técnicas de células baseadas em citometria de fluxo e colônia podem ser usadas para identificar e diferenciar subconjuntos enriquecidos para células-tronco hematopoiéticas de longo prazo de progenitores comprometidos. Células-tronco humanas positivas CD34 podem ser eficientemente modificadas por genes usando vetores lentivirais.
As células que carregam uma cópia não integrada do diluir vetorial durante o período de ensaio de cultura líquida de 12 dias, enquanto vetores integrados no genoma são passados para toda a descendência. Como confirmado pela expressão do vetor na colônia formando ensaios celulares. Este método pré-clínico pode ser usado para isolar geneticamente modificado em células hematopoiéticas de primatas não-humanas controladas de qualidade e células progenitoras para terapia genética.
Este método pode ser facilmente adaptado para outras espécies, fontes de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras, ferramentas de terapia genética e doenças. Este protocolo completamente controlado mostra grande promessa para a modelagem de terapias eficazes para inúmeras doenças humanas. Tenha em mente que trabalhar com tecidos primatas não humanos requer medidas de segurança aprimoradas, incluindo equipamentos de proteção individual.
