لتقييم كفاءة وسلامة نهج العلاج الجيني الواعدة والرواية ، فإن الاختبار الشامل للخلايا المعدلة جينيًا في قبل الفحص المعتمد في نماذج vivo أمر بالغ الأهمية. الحفاظ على علامات سطح الخلية ذات الصلة'عبر التفاعل من الكواشف، والقدرة على تطبيق نفس العلاجات الداعمة تدار للمرضى على طول نماذج الرئيسيات غير البشرية لمحاكاة المعلمات السريرية عن كثب. إظهار الإجراء معي سيكون أنا بيريز، فني أبحاث من مختبر الدكتور هانز بيتر كيم.
تبدأ بإضافة 10 إلى 12 ملليلتر aliquots من نخاع العظام معزولة عن متبرع رئيسي غير الإنسان صحية في أنابيب مخروطية 50 ملليلتر. جلب حجم أنبوب يصل إلى 50 ملليلتر مع العازلة النزفية، واحتضان الخلايا لمدة تصل إلى سبع دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي، وتشعّر جميع ما عدا آخر اثنين إلى خمسة ملليلترات من عظمى.
Resuspend بيليه في حجم السوبر المتبقية عن طريق نفض الغبار الأنبوب, ونقل تعليق نخاع العظام في أنبوب جديد 50 ملليلتر باستخدام مصفاة خلية المسام 70 ميكرومتر لإزالة أي جلطات الدم. إضافة عازلة انحلالية جديدة لجعل حجم يصل إلى 50 ملليلتر، واحتضان الخلايا لمدة خمس دقائق أخرى في درجة حرارة الغرفة قبل جمعها عن طريق الطرد المركزي. استلهم جميع من افراط و resuspend الخلايا في 10 ملليلتر من الحد الأقصى العازلة.
قبل تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة أخرى 70 ميكرومتر المسام، شطف الأنبوب مع 40 ملليلتر من المخزن المؤقت الطازج، وبركة الغسيل مع تعليق الخلية. بعد إثراء للخلايا إيجابية CD34 وفقا للمعايير المغناطيسي بمساعدة الخلايا بروتوكولات الفرز، وغسل الخلايا المعزولة حبة في ما يصل إلى 50 ملليلتر من العازلة ماكس الطازجة، وإعادة تثبيت بيليه في HSPC المتوسطة. ثم لوحة 10 إلى 20 ملليلتر من الخلايا في الأنسجة تنفيس مثقف يعالج قارورة T75 لثقافتها بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ حاضنة ثاني أكسيد الكربون.
لتقييم نقاء ما قبل ما بعد التخصيب لعينات خلايا نخاع العظم إنشاء بروتوكول تدفق الخلايا مع المؤامرات المناسبة والتسلسل الهرمي للسكان تظهر جميع البوابات لجميع الأحداث مبعثر، CD34 إيجابية، الخلايا الجذعية الدموية، متعددة القدرات a-erythro النخاعي progenitors وprogenitors النخاعي اللمفاوي. المقبل، تشغيل غير المطّوع، قبل التخصيب، عينة خلايا الدم البيضاء لضبط الفولتية لالمعلمات إلى الأمام والجانب مبعثر، وجميع القنوات المفلورة تليها حبات التعويض الملون واحد لضبط التعويض بين القنوات المجاورة. ثم تشغيل جميع العينات المتبقية غير الملطخة والملطخة مع بروتوكول المعدلة والمعوضة لتوثيق كفاءة التخصيب CD34.
عندما تم تعيين جميع التعويضات تكوين فرز الخلية لتنقية الفرز من المجموعات الفرعية CD34 في مستعمرة تشكيل الخلية المقايسات، وتحميل أنبوب عينة CD34 المخصب الملون على مقياس الخلايا. ثم سجل 2000 إلى 3000 الأحداث ، وضبط غرامة بوابات الفرز لتناسب قوة الإشارة والسكان المستهدفين. عند اكتمال الإعداد الحصول على الخلايا ضبط معدل التدفق إلى 500 إلى 1000 خلية في الثانية الواحدة، وفرز 800 إلى 1200 الخلايا من مبعثر، CD34 إيجابية، الخلايا الجذعية الدموية، متعددة القدرات a-erythro السلف النخاعي وبوابات السلف النخاعي اللمفاوي في أنابيب منفصلة تحتوي على 3.6 ملليلتر مستعمرة تشكيل خلية متوسطة لكل أنبوب.
في نهاية دوامة النوع أنابيب الجمع ، وإضافة ملليلتر واحد من تعليق الخلية إلى ثلاثة معقمة 3.5 سنتيمتر ، عالجت ثقافة غير الأنسجة أطباق بيتري محددة داخل أطباق بتري فردية 15 سنتيمترًا لكل مجموعة خلايا لاحتضانها لمدة 10-14 يومًا عند 37 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي استخدام ماصة 10 ملليلتر لشطف بلطف الخلايا الملتصمة من أسفل كل قارورة مع HBSS العقيمة، وجمع الخلايا المحصودة عن طريق الطرد المركزي. resuspend الخلايا في وسيطة النقل في 1 × 10 إلى الخلايا 6 لكل ملليلتر التركيز.
وإضافة ملليلتر واحد من الخلايا للسيطرة وهمية في بئر واحد من جزء الليفي المؤتلف المغلفة 12 لوحة جيدا لاحتضان بين عشية وضحاها في حاضنة ثقافة الخلية. ثم إضافة 10 ملليلتر aliquots من الخلايا المتبقية في الليفية المؤتلفة قارورة T75 المغلفة لاحتضان 30 دقيقة في حاضنة ثقافة الخلية مع أغطية تنفيس. أثناء الاحتضان ذوبان الفيروس مشروطة عينات متوسطة وحساب كمية الفيروس إلى أن تضاف على أساس titer وعدد وحدات معدية من الخلايا لكل ملليلتر.
اتخاذ قارورة من الحاضنة وإضافة حجم مناسب من الفيروس مشروطة المتوسطة لكل قارورة قبل العودة إلى الخلايا 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في صباح اليوم التالي نقل الخلايا من قارورة إلى أنابيب مخروطية 50 ملليلتر الفردية. اغسل الخلايا بما يصل إلى 50 ملليلتر من HBSS لكل غسل، وكرر هذه الخطوة حتى ثلاث مرات لإزالة الفيروس المتبقي.
احتضان الخلايا لمدة ساعتين في وسائل الإعلام HSPC تكمل مع بروستاغلاندين E2. ثم غسل الخلايا وإعادة تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من HBSS تستكمل مع مصل 2٪autologous لكل أنبوب. ثم pirate تعليق الخلية باستخدام حقنة 20 ملليلتر مجهزة إبرة قياس 16.5. غسل داخل الأنبوب مع HBSS الطازجة بالإضافة إلى مصل 2٪ الذاتية، وpirpirate في الحقنة.
اِحتفَ الحقنة بعناية بغطاء الإبرة قبل وضع محلول الخلية على الجليد حتى ضخها في مضيف ذاتي. لتحديد كفاءة التعديل الجيني للخلايا المستحثة، لوحة 1 × 10 إلى الخلايا الصورية أو المستحثة 6 محفوظة لكل ملليلتر من HSPC المتوسطة على غير الأنسجة ثقافة اللوحات المعالجة. في الأيام الثانية والخامسة والثانية عشر بعد النقل، حصاد وفرز الخلايا.
في اليومين الثاني والخامس، اُعيد 33٪ من الخلايا في وسط HSPC الطازج بتركيز 1 × 10 إلى 6 لكل ملليلتر. في أيام اثنين وخمسة واثني عشر، تجميد 33٪ من الخلايا في العازلة استخراج الحمض النووي لPCR في الوقت الحقيقي الكمية، وتحليل 33٪ النهائي من الخلايا عن طريق تدفق الخلايا وفقا للبروتوكولات القياسية لتقييم تكوين فينوتيبيك من ذرية الدم. لقياس التعبير عبر الجنين بواسطة عملية تدفق، إضافة ثلاثة جانب إضافي مبعثر مقابل.
transgene المؤامرات؛ وبوابة المؤامرة الأولى على الخلايا الجذعية الدموية، والمؤامرة الثانية على متعدد القدرات وSethro السلف النخاعية، والمؤامرة الثالثة على النسل النخاعي اللمفاوي، كل مقابل transgene. ثم سجل 2000 إلى 3000 الأحداث وغرامة ضبط بوابات الفرز لتناسب قوة الإشارة والسكان المستهدفين.
باستخدام هذا البروتوكول عدد غير البشرية الرئيسيات CD34 إيجابية HSPC التي يتم إثراء عادة متناسبة مع إجمالي عدد خلايا الدم البيضاء الإدخال. كما أثبتت النتائج السابقة أن مجموع CD34 إيجابية المنتج HSPC يشمل الخلايا التي ليست صحيحة على المدى الطويل وتطعيم الخلايا الجذعية الدموية، وهذه الخلايا الخلوية تدفق القائمة والمستعمرة تشكيل تقنيات الخلايا يمكن استخدامها لتحديد موثوق وتفريق المجموعات الفرعية المخصبة لالخلايا الجذعية الدموية على المدى الطويل من progenitors ملتزمة. يمكن أن تكون الخلايا الجذعية البشرية الإيجابية CD34 المخصبة الخلايا بكفاءة الجينات تعديل باستخدام ناقلات العدسي الفيروسات.
الخلايا التي تحمل نسخة غير متكاملة من المتجه تمييع على مدى فترة اختبار الثقافة السائلة لمدة 12 يومًا ، في حين أن النواقل المتكاملة في الجينوم تنتقل إلى جميع النسل. كما أكد التعبير عن ناقلات في القولون تشكيل الخلية المقايسة. ويمكن استخدام هذه الطريقة قبل السريرية لعزل المعدلة وراثيا في نوعية الخاضعة للرقابة غير الإنسان الرئيسيات الجذعية الدموية والخلايا السلف للعلاج الجيني.
ويمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة لأنواع أخرى، ومصادر الجذعية والخلايا السلف، وأدوات العلاج الجيني والأمراض. هذا البروتوكول فحص بدقة يظهر وعدا كبيرا لنمض النمذجة من العلاجات فعالة للعديد من الأمراض البشرية. ضع في اعتبارك أن العمل مع أنسجة الرئيسيات غير البشرية يتطلب تدابير أمنية معززة بما في ذلك معدات الحماية الشخصية.
