この方法は比較的簡単で、アカゲザルB細胞の効率的な遺伝子編集を可能にします。この方法は、アカゲザルの治療目的で遺伝子編集されたB細胞の試験を可能にする。また、前臨床B細胞療法の研究にも適しています。
一般的な方法は、他の細胞型に適合させてもよい。手順が正しく実行されていれば、闘争を期待するべきではありません。ただし、gRNA切断効率と組換えAAV6提供テンプレートの高品質のバッチが重要です。
まず、B細胞培養培地を摂氏37度のウォーターバスで予熱します。B細胞刺激剤を氷上で解凍します。事前に温めた解凍媒体を含む適切なサイズのチューブを準備します。
初代アカゲザル脾細胞またはPBMCのバイアル1〜2本を摂氏37度の水浴で解凍します。脾細胞を、予め温めた融解培地を含む準備されたチューブにデカントします。クライオチューブをすすぎ、すべての細胞を収集します。
細胞を200 Gで室温で10分間遠心分離します。上清を捨て、洗浄のために細胞を10ミリリットルの解凍培地に再懸濁します。遠心分離を3回繰り返して、凍結培地を除去します。
最後の遠心分離後、B細胞培養培地に推定5回10〜6細胞/ミリリットルで細胞を再懸濁する。10マイクロリットルの細胞懸濁液を10マイクロリットルの0.4%トリパンブルーと組み合わせ、血球計算盤で細胞をカウントします。細胞数に応じてB細胞培養液で細胞濃度を10ミリリットルあたり6細胞から3倍に調整する。
次に、B細胞刺激剤を最終濃度に添加して混合します。細胞を細胞培養皿に移し、摂氏37度で5%二酸化炭素で48時間インキュベートします。沈降後、細胞は密な単層を形成するはずであり、細胞の小さなクラスターはすでに見えているかもしれません。
約2日後、細胞は健康で不規則になり、目に見えて大きなクラスターを形成しているはずです。B細胞を活性化した後、エレクトロポレーションおよび形質導入用の試薬を調製する。DMSOヌクレアーゼフリーの二重鎖バッファー、バッファーT、およびバッファーEまたはE2をエレクトロポレーションキットから室温に予熱します。
rAAV6相同性指向修復テンプレート(HDRT)とB細胞刺激剤を氷上で解凍します。CRISPR Cas9シングルガイドRNA(sgRNA)を100マイクロモルの二重鎖バッファーに再懸濁します。室温で10分間再構成し、ボルテックスとフリックによって混合します。
再構成したsgRNAを、使用するまで氷上に置きます。10マイクロリットルのエレクトロポレーションでは、550マイクロリットルのB細胞培養培地を刺激剤と1%DMSOで調製します。抗生物質の有無にかかわらず、この培地50マイクロリットルを48ウェル細胞培養プレートに加えます。
次に、rAAV6 HDRTをウェルの体積の最大20%までウェル内の培地に追加します。準備した皿と残りの培地をインキュベーター内で摂氏37度で5%二酸化炭素で予熱します。次に、10マイクロリットルのエレクトロポレーションのために、0.4マイクロリットルの61マイクロモルCas9と0.75マイクロリットルの100マイクロモルsgRNAを二重鎖バッファー中で混合することにより、1.15マイクロリットルのリボ核タンパク質(RNP)を調製します。
RNPを室温で15分間インキュベートしてから、細胞と混合します。インキュベーション後、複数の遺伝子座を同時に標的にする場合は、複数のRNPを組み合わせることができます。次に、エレクトロポレーション用のセルを準備します。
温度衝撃を避けるために、セルを室温のままにしておきます。インキュベーション後、細胞を適切な容器に回収します。皿をDPBSですすぎ、最大数の細胞を収集します。
細胞を200 Gで10分間遠心分離します。上清を廃棄し、培養液に入れた細胞数に基づいて、1ミリリットルあたり約2倍の10〜6細胞で細胞をDPBSに再懸濁します。等量の細胞懸濁液と0.4%トリパンブルーを組み合わせ、血球計算盤を使用してカウントします。
遠心分離して上清を廃棄した後、細胞数に基づいて10〜ミリリットルあたり7細胞を5.55倍で予め加温した緩衝液Tに細胞を再懸濁する。トランスフェクションシステムをセットアップするには、マシンの電源を入れ、1, 350 V、15 ミリ秒、1パルスに設定します。ピペットステーションを層流フードの内側に配置します。
10個のエレクトロポレーションのセットごとに、3ミリリットルのバッファーを含むトランスフェクションチューブを準備します E.チューブをピペットステーションに挿入します。エレクトロポレーションごとに1.15マイクロリットルのRNPと9マイクロリットルの細胞を組み合わせます。気泡を避けるために少なくとも20%以上準備し、エレクトロポレーションの前に室温で1分間インキュベートします。
10マイクロリットルのRNPと細胞の混合物をエレクトロポレーションピペットのエレクトロポレーションチップに吸引します。ロードしたピペットをピペットステーションに挿入し、エレクトロポレーションを開始します。アーク放電を防ぐために、チップに気泡が完全にないことを確認してください。
エレクトロポレーションした細胞を、準備したあらかじめ温めた少量の培地(rAAV6の有無にかかわらず)に直ちに48ウェル内に排出します。トランスフェクションなしでコントロールサンプルを培養ウェルに追加します。細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素で4〜6時間インキュベートします。
インキュベーションの最後に、覚醒剤、DMSO、および抗生物質の有無にかかわらず、事前に温めた450マイクロリットルのB細胞培養培地をプレートに加えます。24時間後にゲノムDNA分析を実行します。デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で、相同性アームの外側のプライマーとインサート内のプライマーを使用して、編集効率を定量化します。
PCRを実行して挿入部位を増幅し、サンガーシーケンシングを実行して正しい編集を確認します。タンパク質レベルを分析するには、エレクトロポレーション後40〜48時間細胞を培養してタンパク質発現の変化を可能にし、フローサイトメトリーによる分析を実行します。テトラサイクリン対応の自己サイレンシングアデノウイルスヘルパーを使用したrAAV6の生産は、細胞培養培地1ミリリットルあたり10〜10 GCの4倍の生産をもたらし、ヘルパーフリーのトリプルトランスフェクションを使用した生産を30〜40倍上回りました。
オプションの精製により、CD3 + T細胞とCD14 +およびCD16 +骨髄系細胞の大部分が排除され、80〜95%のCD20 + B細胞の純度が日常的に得られました。初代アカゲザルB細胞の遺伝子編集をここに示します。この研究では、高い細胞生存率を維持しながら、同時に80%B細胞における軽鎖発現を欠失させた。
B細胞の大部分は依然としてアイソタイプIgMを発現していた。抗体1485 HDRTをコードするrAAV6の添加は、未編集のB細胞よりも抗体鎖の蛍光強度が低いにもかかわらず、B細胞の16〜21%で遺伝子編集および抗体1485表面発現をもたらした。1%DMSOを添加し、rAAV6 HDRTで濃縮インキュベーションすることで、一般的に編集効率が向上しました。
この方法を使用すると、個々のアカゲザルとrAAV6 HDRTバッチの品質に応じて、通常5〜20%、最大40%の編集効率が達成されました。エレクトロポレーションを行う際は、トランスフェクションに十分なミックスがあり、先端に気泡がないことを確認してください。細胞は、任意の所望の方法によって分析することができ、またはアカゲザルのドナーへの自家移植を行うことができる。
