Para evaluar la eficiencia y la seguridad de enfoques de terapia génica prometedores y novedosos, es crucial realizar pruebas exhaustivas de células modificadas genéticamente en modelos preclínicos in vivo validados. La conservación de la reactividad cruzada de los reactivos de los marcadores de superficie celular relevantes y la capacidad de aplicar los mismos tratamientos de apoyo administrados a los pacientes a lo largo de modelos de primates no humanos para imitar de cerca los parámetros clínicos. Demostrando el procedimiento conmigo estará Anai Pérez, un técnico de investigación del laboratorio del Dr.Hans-Peter Kiem.
Comience agregando alícuotas de 10 a 12 mililitros de médula ósea aisladas de un donante sano de primates no humanos en tubos cónicos de 50 mililitros. Lleve el volumen del tubo hasta 50 mililitros con tampón hemolítico e incubar las células hasta siete minutos a temperatura ambiente. Retire los restos celulares por centrifugación, y aspire todos menos los últimos dos a cinco mililitros del sobrenadante.
Resuspender el pellet en el volumen de sobrenadante residual moviendo el tubo, y transferir las suspensiones de la médula ósea a un nuevo tubo de 50 mililitros utilizando un colador de células de poro de 70 micrómetros para eliminar cualquier coágulo de sangre. Agregue un tampón hemolítico fresco para subir el volumen a 50 mililitros, e incubar las células durante otros cinco minutos a temperatura ambiente antes de su recolección por centrifugación. Aspirar todo el sobrenadante y resuspender las células en 10 mililitros de tampón máximo.
Antes de filtrar la suspensión celular a través de otro colador de poro de 70 micrómetros, enjuague el tubo con 40 mililitros de tampón fresco y acoja el lavado con la suspensión celular. Después de enriquecer para células positivas CD34 de acuerdo con los protocolos de clasificación de células asistidas magnéticas estándar, lave las células aisladas del cordón en hasta 50 mililitros de tampón máximo fresco, y resuspend el pellet en medio HSPC. A continuación, la placa de 10 a 20 mililitros de las células en el tejido ventilado cultivado T75 comprimidos T75 para su cultivo nocturno en una incubadora de 37 grados centígrados y 5%dióxido de carbono.
Para evaluar la pureza previa y posterior al enriquecimiento de las muestras celulares de la médula ósea, cree un protocolo de citometría de flujo con las gráficas adecuadas y la jerarquía poblacional que muestre todas las puertas para la dispersión de todos los eventos, células madre hematopoyéticas CD34 positivas, progenitores mieloides multipotentes an-eritro y progenitores linfometos. A continuación, ejecute una muestra de glóbulos blancos sin mancha, pre-enriquecimiento, para ajustar los voltajes para los parámetros de dispersión hacia adelante y lateral, y todos los canales de fluorescencia seguidos de cuentas de compensación de manchas individuales para ajustar la compensación entre los canales adyacentes. A continuación, ejecute todas las muestras no manchadas y manchadas restantes con el protocolo ajustado y compensado para documentar la eficiencia de enriquecimiento de CD34.
Cuando se hayan establecido todas las compensaciones, configure el clasificador de células para la purificación de la clasificación de los subconjuntos CD34 en ensayos de células formadoras de colonias, y cargue el tubo de muestra enriquecido CD34 manchado en el citómetro. A continuación, registre de 2000 a 3000 eventos, y ajuste con precisión las puertas de clasificación para que se ajusten a la intensidad de la señal y a las poblaciones objetivo. Cuando la configuración es completa adquirir las celdas ajustando el caudal a 500 a 1000 celdas por segundo, y la clasificación de 800 a 1200 células de la dispersión, CD34 positivo, célula madre hematopoyética, progenitor mieloide multipotente y compuertas progenitoras mieloide linfáticas en tubos separados que contienen 3,6 mililitros de colonia formando medio de células formadoras por tubo.
Al final del vórtice de clasificación, los tubos de recolección, y agregue un mililitro de suspensión celular a tres platos estériles de 3,5 centímetros tratados con cultivo de cultivo no tejido situados dentro de platos individuales de petri de 15 centímetros por población celular para su incubación de 10-14 días a 37 grados centígrados. A la mañana siguiente utilice una pipeta de 10 mililitros para enjuagar suavemente las células adherentes de la parte inferior de cada matraz con HBSS estéril, y recoger las células cosechadas por centrifugación. Resuspender las células en medio de transducción a una concentración de 1 x 10 a 6a células por mililitro.
Y agregue un mililitro de células para el control simulado en un pozo de un fragmento de fibronectina recombinante recubierto de 12 pozos para una incubación durante la noche en la incubadora de cultivo celular. A continuación, añada 10 mililitros alícuotas de las células restantes en matraces T75 recubiertos con fragmentos de fibronectina recombinantes para una incubación de 30 minutos en la incubadora de cultivo celular con las tapas ventiladas. Durante la incubación se descontaron muestras medias condicionadas por el virus y calculan la cantidad de virus que se añadirá en función del título y el número de unidades infecciosas de células por mililitro.
Saque el matraz de la incubadora y añada el volumen adecuado de medio condicionado por virus a cada matraz antes de devolver las células a 37 grados centígrados y al 5% de dióxido de carbono. A la mañana siguiente transfiera las células del matraz a tubos cónicos individuales de 50 mililitros. Lave las células en hasta 50 mililitros de HBSS por lavado, y repita este paso hasta tres veces para eliminar el virus residual.
Incubar las células durante dos horas en medios HSPC complementados con prostaglandina E2. Luego lave las células y resusppend las células en 10 mililitros de HBSS complementados con 2%suero autólogo por tubo. A continuación, aspirar las suspensiones celulares utilizando una jeringa de 20 mililitros equipada con una aguja de calibre 16,5. Lave el interior del tubo con HBSS fresco más 2% de suero autólogo, y aspire en la jeringa.
Tapar cuidadosamente la jeringa con el capuchón de la aguja antes de colocar la solución celular sobre hielo hasta su perfusión en un huésped autólogo. Para determinar la eficiencia de modificación genética de las células transducidas, la placa 1 x 10 a la 6a células simuladas o transducidas reservadas por mililitro de medio HSPC en placas tratadas de cultivo no tisular. En los días dos, cinco y doce después de la transducción, cosechar y contar las células.
En los días dos y cinco, vuelva a planchar el 33% de las células en un medio HSPC fresco a una concentración de 1 x 10 a la 6a por mililitro. En los días dos, cinco y doce, congelar el 33% de las células en el tampón de extracción de ADN para pcR cuantitativa en tiempo real, y analizar el 33% final de las células por citometría de flujo de acuerdo con los protocolos estándar para evaluar la composición fenotípica de la progeniedad hematopoyética. Para cuantificar la expresión de transgenes por citometría de flujo, agregue tres dispersión lateral adicionales frente a.
parcelas transgenes;y puerta la primera parcela en las células madre hematopoyéticas, la segunda parcela en los progenitores mieloides multipotentes an-eritro, y la tercera parcela sobre los progenitores mieloides linfáticos, todos contra el transgén. A continuación, registre de 2000 a 3000 eventos y ajuste de forma fina las puertas de clasificación para que se ajusten a la intensidad de la señal y a las poblaciones objetivo.
Usando este protocolo el número de HSPC positivos CD34 de primate no humanos que se enriquecen es típicamente proporcional al recuento total de glóbulos blancos de entrada. Como los hallazgos anteriores han demostrado que el producto total de HSPC positivo CD34 incluye células que no son verdaderas a largo plazo y el injerto de células madre hematopoyéticas, estas técnicas de células formadoras de colonias basadas en citometría de flujo y basadas en colonias se pueden utilizar para identificar y diferenciar de forma confiable subconjuntos enriquecidos para células madre hematopoyéticas a largo plazo de progenitores comprometidos. Las células enriquecidas con células madre humanas positivas CD34 pueden modificarse eficientemente utilizando vectores lentivirales.
Las células que llevan una copia no integrada del vector se diluyen durante el período de ensayo de cultivo líquido de 12 días, mientras que los vectores integrados de forma estable en el genoma se transmiten a toda la progenie. Como confirma la expresión del vector en ensayos celulares formadores de colonias. Este método preclínico se puede utilizar para aislar genéticamente modificado en células hematopoyéticas de primate no humanos controladas de calidad y células progenitoras para la terapia génica.
Este método se puede adaptar fácilmente para otras especies, fuentes de células madre y progenitoras hematopoyéticas, herramientas de terapia génica y enfermedades. Este protocolo completamente examinado muestra una gran promesa para el modelado de terapias eficaces para numerosas enfermedades humanas. Tenga en cuenta que trabajar con tejidos de primates no humanos requiere mejores medidas de seguridad, incluido el equipo de protección personal.
