Per valutare l'efficienza e la sicurezza di approcci di terapia genica promettenti e nuovi, è fondamentale il test completo delle cellule geneticamente modificate in modelli preclinici in vivo convalidati. La conservazione della reattività incrociata dei reagenti dei marcatori di superficie cellulare pertinenti e la capacità di applicare gli stessi trattamenti di supporto somministrati ai pazienti lungo modelli di primati non umani per imitare strettamente i parametri clinici. A dimostrare la procedura con me sarà Anai Perez, un tecnico di ricerca del laboratorio del Dr.Hans-Peter Kiem.
Inizia aggiungendo da 10 a 12 millilitri di midollo osseo isolati da un donatore di primati non umani sani in tubi conici da 50 millilitri. Portare il volume del tubo fino a 50 millilitri con tampone emolitico e incubare le cellule per un massimo di sette minuti a temperatura ambiente. Rimuovere i detriti cellulari per centrifugazione e aspirare tutti tranne gli ultimi due o cinque millilitri del supernatante.
Rimescolare il pellet nel volume supernatante residuo facendo scorrere il tubo e trasferire le sospensioni del midollo osseo in un nuovo tubo da 50 millilitri utilizzando un filtro cellulare a poro da 70 micrometri per rimuovere eventuali coaguli di sangue. Aggiungere un tampone emolitico fresco per portare il volume fino a 50 millilitri e incubare le cellule per altri cinque minuti a temperatura ambiente prima della loro raccolta mediante centrifugazione. Aspirare tutto il supernatante e rimescolare le cellule in 10 millilitri di tampone massimo.
Prima di filtrare la sospensione cellulare attraverso un altro filtro poro da 70 micrometri, sciacquare il tubo con 40 millilitri di tampone fresco e mettere in comune il lavaggio con la sospensione cellulare. Dopo aver arricchito per le cellule positive CD34 secondo i protocolli standard di smistamento delle cellule magnetiche assistite, lavare le cellule isolate di perline in un massimo di 50 millilitri di tampone massimo fresco e risospendare il pellet nel mezzo HSPC. Quindi placcare da 10 a 20 millilitri delle cellule in flaconi T75 trattati con tessuto ventilato per la loro coltura notturna in un incubatore di anidride carbonica di 37 gradi celsius e 5%.
Per valutare la purezza pre e post arricchimento dei campioni cellulari del midollo osseo creare un protocollo di citometria a flusso con i grafici appropriati e la gerarchia della popolazione che mostra tutte le porte per tutti gli eventi scatter, CD34 positivo, cellule staminali ematopoietiche, progenitori mieloidi an-eritemo multipotenti e progenitori mieloidi linfomio. Successivamente, eseguire un campione di globuli bianchi non contaminato, pre-arricchimento, per regolare le tensioni per i parametri di dispersione avanti e laterale e tutti i canali di fluorescenza seguiti da singole perline di compensazione macchiata per regolare la compensazione tra i canali adiacenti. Quindi eseguire tutti i campioni rimanenti non macchiati e macchiati con il protocollo regolato e compensato per documentare l'efficienza di arricchimento del CD34.
Una volta impostate tutte le compensazioni, configurare lo smistatore di celle per il tipo di purificazione dei sottoinsiemi CD34 in test di cellule che formano colonie e caricare il tubo campione arricchito di CD34 colorato sul citometro. Quindi registra da 2000 a 3000 eventi e regola bene i cancelli di ordinamento per adattarsi alla potenza del segnale e alle popolazioni bersaglio. Una volta completata la configurazione, acquisire le cellule regolando la portata a 500-1000 cellule al secondo e ordinando da 800 a 1200 cellule dalla dispersione, CD34 positive, cellule staminali ematopoietiche, progenitore mieloide an-eritemo multipotente e porte progenitrici mieloidi linfoploidi in tubi separati contenenti 3,6 millilitri di colonia che formano il mezzo cellulare per tubo.
Alla fine del vortice di ordinamento i tubi di raccolta e aggiungere un millilitro di sospensione cellulare a tre sterili 3,5 centimetri, coltura non tissutale trattata piastre di Petri impostate all'interno di singole piastre di Petri di 15 centimetri per popolazione cellulare per la loro incubazione di 10-14 giorni a 37 gradi celsius. La mattina successiva utilizzare una pipetta da 10 millilitri per risciacquare delicatamente le cellule aderenti dal fondo di ogni pallone con HBSS sterile e raccogliere le cellule raccolte per centrifugazione. Resospendare le cellule in mezzo di trasduzione ad un 1 x 10 alla 6a concentrazione di cellule per millilitro.
E aggiungere un millilitro di cellule per il finto controllo in un pozzo di un frammento di fibronecina ricombinante rivestito con 12 piastre di pozzo per un'incubazione notturna nell'incubatrice di coltura cellulare. Quindi aggiungere aliquote di 10 millilitri delle cellule rimanenti in contenitori di fibronectina ricombinante rivestiti con T75 per un'incubazione di 30 minuti nell'incubatore di coltura cellulare con i tappi sfiatati. Durante l'incubazione il virus del disgelo ha condizionato campioni medi e calcolato la quantità di virus da aggiungere in base al formicolio e al numero di unità infettive di cellule per millilitro.
Esenzi il pallone dall'incubatrice e aggiungi il volume appropriato di mezzo condizionato dal virus a ogni pallone prima di riportare le cellule a 37 gradi celsius e 5% di anidride carbonica. La mattina seguente trasferire le cellule dal pallone in singoli tubi conici da 50 millilitri. Lavare le cellule in un massimo di 50 millilitri di HBSS per lavaggio e ripetere questo passaggio fino a tre volte per rimuovere il virus residuo.
Incubare le cellule per due ore in mezzi HSPC integrati con prostaglandina E2. Quindi lavare le cellule e rimorsi le cellule in 10 millilitri di HBSS integrati con siero autologo al 2% per tubo. Quindi aspirare le sospensioni cellulari utilizzando una siringa da 20 millilitri dotata di un ago calibro 16,5. Lavare l'interno del tubo con HBSS fresco più siero autologo al 2% e aspirarlo nella siringa.
Limitare con cura la siringa con il cappuccio dell'ago prima di posizionare la soluzione cellulare sul ghiaccio fino alla sua infusione in un ospite autologo. Per determinare l'efficienza di modifica genica delle cellule trasdutte, la piastra da 1 x 10 alla 6a cellule fittizie o trasdotto riservate per millilitro di mezzo HSPC su piastre trattate con coltura non tissutale. Nei giorni due, cinque e dodici post-trasduzione, raccogliere e contare le cellule.
Nei giorni due e cinque, ripiebrare il 33% delle cellule in mezzo HSPC fresco a una concentrazione da 1 x 10 a 6 ° per millilitro. Nei giorni due, cinque e dodici, congelare il 33% delle cellule nel buffer di estrazione del DNA per la PCR quantitativa in tempo reale e analizzare il 33% finale delle cellule per citometria del flusso secondo protocolli standard per valutare la composizione fenotipico della progenie ematopoietica. Per quantificare l'espressione transgena in base alla citometria del flusso, aggiungere tre dispersione laterale aggiuntiva rispetto.
trame transgene;e cancello il primo appezzamento sulle cellule staminali ematopoietiche, il secondo appezzamento sui progenitori mieloidi an-erythro multipotenti, e il terzo appezzamento sui progenitori mieloidi linfomio, tutti contro il transgene. Quindi registra da 2000 a 3000 eventi e regola bene i cancelli di ordinamento per adattarsi alla potenza del segnale e alle popolazioni target.
Usando questo protocollo il numero di HSPC positivi CD34 di primati non umani che sono arricchiti è tipicamente proporzionale al numero totale di globuli bianchi in ingresso. Come i risultati precedenti hanno dimostrato che il prodotto HSPC positivo cd34 totale include cellule che non sono vere a lungo termine e innestando cellule staminali ematopoietiche, queste tecniche di cellule a base di citometria a flusso e di formazione di colonie possono essere utilizzate per identificare e differenziare in modo affidabile sottoinsiemi arricchiti per cellule staminali ematopoietiche a lungo termine da progenitori impegnati. Le cellule staminali umane positive CD34 possono essere modificate in modo efficiente utilizzando vettori lentivirali.
Le cellule che trasportano una copia non integrata del vettore si diluivano durante il periodo di dosaggio della coltura liquida di 12 giorni, mentre i vettori stabilmente integrati nel genoma vengono trasmessi a tutta la progenie. Come confermato dall'espressione del vettore nella colonia che forma saggi cellulari. Questo metodo preclinico può essere utilizzato per isolare geneticamente modificato in cellule staminali ematopoietiche di primate non umane controllate di qualità e cellule progenitrici per la terapia genica.
Questo metodo può essere facilmente adattato per altre specie, fonti di cellule staminali ematopoietiche e progenitrici, strumenti di terapia genica e malattie. Questo protocollo accuratamente controllato mostra grandi promesse per la modellazione di terapie efficaci per numerose malattie umane. Tieni presente che lavorare con tessuti di primati non umani richiede misure di sicurezza migliorate, compresi i dispositivi di protezione individuale.
