Für die Bewertung der Effizienz und Sicherheit vielversprechender und neuartiger Gentherapieansätze ist die umfassende Prüfung genmodifizierter Zellen in validierten präklinischen In-vivo-Modellen von entscheidender Bedeutung. Die Erhaltung der Kreuzreaktivität von Reagenzien von relevanten Zelloberflächenmarkern und die Fähigkeit, die gleichen unterstützenden Behandlungen anzuwenden, die Patienten entlang nichtmenschlicher Primatenmodelle verabreicht werden, um klinische Parameter genau nachzuahmen. Mit mir wird Anai Perez, eine Forschungstechnikerin aus dem Labor von Dr.Hans-Peter Kiem, das Verfahren demonstrieren.
Beginnen Sie mit 10 bis 12 Milliliter Aliquots Knochenmark isoliert von einem gesunden nichtmenschlichen Primatenspender in 50 Milliliter konische Röhren. Bringen Sie das Volumen der Röhre auf 50 Milliliter mit hämolytischem Puffer und inkubieren Sie die Zellen für bis zu sieben Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Zellablagerungen durch Zentrifugation, und aspirieren Sie alle bis auf die letzten zwei bis fünf Milliliter des Überstandes.
Setzen Sie das Pellet im Restüberstandvolumen wieder auf, indem Sie das Rohr durchstreichen, und übertragen Sie die Knochenmarksuspensionen in ein neues 50-Milliliter-Rohr mit einem 70-Mikrometer-Porenzellsieb, um Blutgerinnsel zu entfernen. Fügen Sie einen frischen hämolytischen Puffer hinzu, um das Volumen auf 50 Milliliter zu erhöhen, und brüten Sie die Zellen für weitere fünf Minuten bei Raumtemperatur vor ihrer Entnahme durch Zentrifugation. Aspirieren Sie alle Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter max Puffer.
Bevor Sie die Zellsuspension durch ein weiteres 70 Mikrometer Porensieb filtern, spülen Sie das Rohr mit 40 Millilitern frischer Puffer ab und bündeln Sie die Wäsche mit der Zellsuspension. Nach der Anreicherung für CD34-positive Zellen nach Standard-Magnetunterstützten-Zell-Sortierprotokollen die Perlenisolierten zellen in bis zu 50 Milliliter frischer Maximalpuffer waschen und das Pellet im HSPC-Medium wieder aufhängen. Dann Platte 10 bis 20 Milliliter der Zellen in belüfteten Gewebe kultiviert behandelt T75-Flaschen für ihre Nachtkultur in einem 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator.
Um die Reinheit der Zellproben des Knochenmarks vor und nach der Anreicherung zu bewerten, wird ein Flow-Zytometrie-Protokoll mit den entsprechenden Plots und der Populationshierarchie erstellt, das alle Tore für alle Ereignisse Streuung, CD34-positive, hämatopoetische Stammzellen, multipotente an-erythro myeloische Vorläufer und lymphomyeloische Vorläufer zeigt. Führen Sie anschließend eine ungefärbte, voranreicherte, weiße Blutkörperchenprobe durch, um die Spannungen für die vorderen und seitlichen Streuparameter und alle Fluoreszenzkanäle, gefolgt von einzelnen gebeizten Kompensationsperlen, anzupassen, um die Kompensation zwischen benachbarten Kanälen anzupassen. Führen Sie dann alle verbleibenden ungefärbten und gebeizten Proben mit dem angepassten und kompensierten Protokoll aus, um die Anreicherungseffizienz des CD34 zu dokumentieren.
Wenn alle Kompensationen gesetzt sind, konfigurieren Sie den Zellsortierer für die Sortierung der CD34-Teilmengen in koloniebildende Zellassays und laden Sie das mit Dercd34 angereicherte Probenrohr auf das Zytometer. Dann zeichnen Sie 2000 bis 3000 Ereignisse auf, und passen Sie die Sortierungstore fein an die Signalstärke und die Zielpopulationen an. Wenn das Setup abgeschlossen ist, erfassen Sie die Zellen, die die Durchflussrate auf 500 bis 1000 Zellen pro Sekunde einstellen, und sortieren 800 bis 1200 Zellen aus der Streuung, CD34-positive, hämatopoetische Stammzelle, multipotente an-erythro myeloische Progenitor und Lympho myeloische Vorläufertore in separate Röhren mit 3,6 Millilitern koloniebildenden Zellmediums pro Tube.
Am Ende des Sortexs die Sammelröhrchen, und fügen Sie einen Milliliter Zellsuspension zu drei sterilen 3,5 Zentimeter, Nicht-Gewebe-Kultur behandelt Petrischalen in einzelnen 15 Zentimeter Petrischalen pro Zellpopulation für ihre 10-14-Tage-Inkubation bei 37 Grad Celsius gesetzt. Am nächsten Morgen verwenden Sie eine 10 Milliliter Pipette, um die anhaftenden Zellen von der Unterseite jedes Kolbens mit sterilem HBSS sanft zu spülen und die geernteten Zellen durch Zentrifugation zu sammeln. Setzen Sie die Zellen im Transduktionsmedium bei einer Konzentration von 1 x 10 auf die 6. Zelle pro Milliliter wieder aus.
Und fügen Sie einen Milliliter Zellen für die Mock-Kontrolle in einem Brunnen eines rekombinanten Fibronectin-Fragments beschichtet 12 Well-Platte für eine nachtübernachtige Inkubation im Zellkultur-Inkubator. Dann fügen Sie 10 Milliliter Aliquots der verbleibenden Zellen in rekombinante Fibronectin-Fragment beschichtet T75-Flaschen für eine 30-minütige Inkubation im Zellkultur-Inkubator mit den Kappen entlüftet. Während der Inkubation Tauwetter viruskonditionierte mittlere Proben und berechnen die Menge des Virus hinzugefügt werden, basierend auf dem Titer und die Anzahl der infektiösen Einheiten der Zellen pro Milliliter.
Nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und fügen Sie jedem Kolben das entsprechende Volumen des viruskonditionierten Mediums hinzu, bevor Sie die Zellen auf 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid zurückbringen. Am nächsten Morgen übertragen Sie die Zellen aus dem Kolben in einzelne 50 Milliliter konische Röhren. Waschen Sie die Zellen in bis zu 50 Milliliter HBSS pro Wäsche, und wiederholen Sie diesen Schritt bis zu dreimal, um Restviren zu entfernen.
Inkubieren Sie die Zellen für zwei Stunden in HSPC-Medien, ergänzt durch Prostaglandin E2. Dann waschen Sie die Zellen und suspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter HBSS mit 2% autologem Serum pro Tube ergänzt. Dann die Zellsuspensionen mit einer 20-Milliliter-Spritze mit einer 16,5-Spur-Nadel ansaugen. Waschen Sie die Innenseite des Rohres mit frischem HBSS plus 2% autologem Serum und aspirieren Sie in die Spritze.
Verschließen Sie die Spritze vorsichtig mit der Nadelkappe, bevor Sie die Zelllösung auf Eis legen, bis ihre Infusion in einen autologen Wirt gelangt. Zur Bestimmung der Genmodifikationseffizienz der transduzierten Zellen wird die Platte 1 x 10 bis zur 6. reservierten Mock- oder Transduced-Zellen pro Milliliter HSPC-Medium auf nicht-gewebekulturbehandelte Platten bestimmt. An den Tagen zwei, fünf und zwölf nach der Transduktion, Ernten und zählen Sie die Zellen.
An den Tagen zwei und fünf 33% der Zellen in frischem HSPC-Medium mit einer Konzentration von 1 x 10 bis zur 6. Milliliter-Konzentration neu aufteilen. An den Tagen zwei, fünf und zwölf, einfrieren 33% der Zellen in DNA-Extraktionspuffer für quantitative Echtzeit-PCR, und analysieren die letzten 33% der Zellen durch Durchflusszytometrie nach Standardprotokollen, um die phänotytische Zusammensetzung der hämatopoetischen Nachkommen zu bewerten. Um die Transgenexpression durch Durchflusszytometrie zu quantifizieren, fügen Sie drei zusätzliche Seitenstreuung vs.
Transgenplots;und Tor der ersten Handlung auf den hämatopoetischen Stammzellen, das zweite Diagramm auf den multipotenten an-erythro myeloischen Vorläufern und das dritte Diagramm auf den lymphomyeloischen Vorläufern, alle gegen das Transgen. Dann rekorde 2000 bis 3000 Ereignisse auf und justieren die Sortierungstore fein an die Signalstärke und die Zielpopulationen.
Mit diesem Protokoll ist die Anzahl der nichtmenschlichen Primaten-CD34-positiven HSPCs, die angereichert sind, in der Regel proportional zur Gesamtanzahl der weißen Blutkörperchen. Da frühere Ergebnisse gezeigt haben, dass das gesamte CD34-positive HSPC-Produkt Zellen enthält, die nicht wirklich langfristig sind, und hämatopoetische Stammzellen pfropfen, können diese strömungszytometriebasierten und koloniebildenden Zelltechniken verwendet werden, um Submengen, die für langfristige hämatopoetische Stammzellen von engagierten Vorläufern angereichert sind, zuverlässig zu identifizieren und zu unterscheiden. CD34 positive menschliche Stammzell angereicherte Zellen können effizient genmodifiziert werden, indem lentivirale Vektoren verwendet werden.
Zellen, die eine nicht integrierte Kopie des Vektors tragen, verdünnen sich über die 12-tägige Flüssigkultur-Assay-Periode, während stabil integrierte Vektoren im Genom an alle Nachkommen weitergegeben werden. Wie durch die Expression des Vektors in koloniebildenden Zell-Assays bestätigt. Diese präklinische Methode kann verwendet werden, um genetisch veränderte in qualitätskontrollierten nichtmenschlichen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen für die Gentherapie zu isolieren.
Diese Methode kann leicht für andere Arten angepasst werden, Quellen von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen, Gentherapie-Tools und Krankheiten. Dieses gründlich geprüfte Protokoll ist vielversprechend für die Modellierung wirksamer Therapien für zahlreiche menschliche Krankheiten. Denken Sie daran, dass die Arbeit mit nichtmenschlichen Primatengeweben verbesserte Sicherheitsmaßnahmen erfordert, einschließlich persönlicher Schutzausrüstung.
