初代前駆脂肪細胞は、脂肪細胞代謝を制御する分子経路を理解するための貴重な実験系である。ニワトリ胚は、脂肪細胞発生の初期段階から前駆脂肪細胞を単離する機会を提供する。この方法は、高い生存率および成熟脂肪細胞への分化能力の増加を有する細胞を産生するように最適化されており、これは、ひよこの初期脂肪成長および発生胚の機能解析に使用することができる。
脂肪生成分化のプロセスは、ニワトリとヒトの間で非常に匹敵します。したがって、単離された前駆脂肪細胞は、ヒトおよび家禽に関連する研究のための二重提案モデルとして使用することができる。胚体を70%エタノールで綿棒で拭き取り始める。
次いで、消化後の後の工程での濾過中の干渉を防ぐために、滅菌ガーゼで皮膚表面を穏やかにこすり、羽毛を除去した。次に、脚と腹部との間の皮膚を切り取り、一対の大腿骨脂肪貯蔵所を明らかにする。片手で湾曲した鉗子を使用して脚の周りの皮膚を保持し、大腿骨皮下脂肪を優しく除去します。
もう一方の手で。その後、湾曲した鉗子を使用して、デポを脚から静かに引き離します。5ミリリットルの収集媒体を含む15ミリリットルのチューブに組織を移し、脂肪パッドの反対側に対して解剖を繰り返す。
次に、回収した脂肪パッドを滅菌液を入れた60ミリメートルのシャーレに移し、ディッシュを数回旋回させて短時間すすぎます。次いで、脂肪パッドをPBSを含む60ミリメートルのシャーレに移して滅菌溶液をすすいでください。プレートを静かに渦巻き、もう一度PBSで洗ってください。
脂肪組織の消化のために、予め温めた酵素溶液を含む15ミリメートルチューブにそれらを移す。その後、チューブに一対の長いまっすぐなはさみを浸し、最後に溶液中の脂肪組織をできるだけ小さく細かく刻む。ミンチ組織および酵素溶液を25ミリリットルのオートクレーブ処理フラスコに移す。
フラスコをパラフィンフィルムで包み、消化のためにフラスコを摂氏37度のオービタルシェーカーインキュベーターに入れます。消化後、軽く上下にピペットでよく混ぜる。その後、ピペッティングによって250マイクロメートルの組織ストレーナーを通して15ミリリットルのチューブに濾過することによって、未消化組織および破片のビットを除去する。
次に、フラスコを4ミリリットルの成長培地ですすぎ、細胞懸濁液を同じ15ミリリットルのチューブにろ過して、フラスコに付着した細胞を除去します。次に、成長培地を再度ピペッティングしてストレーナーをすすぎ、フィルターに捕捉された細胞をすべて除去します。室温で5分間300倍Gで遠心分離して細胞画分をペレット化し、細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引した。
ペレットを1ミリリットルの赤血球溶解緩衝液に穏やかに再懸濁し、ピペッティングによりよく混合し、室温で5分間インキュベートする。次に、細胞を含むチューブに5ミリリットルの成長培地を加えて細胞を希釈し、ピペッティングによって穏やかに混合する。次に、細胞を40マイクロメートルのセルストレーナーにピペットで固定し、新しい50ミリリットルのチューブにろ過します。
次いで、さらに5ミリリットルの成長培地でストレーナーをすすぎ、室温で7分間300倍Gで遠心分離することによって細胞をペレット化する。上清を慎重に吸引する。残りの細胞ペレットをピペッティングにより1ミリリットルの成長培地に再懸濁し、細胞密度および生存率を決定するために、ピペッティングにより各サンプルの10マイクロリットルをトリパンブルーに混合する。
混合物の10マイクロリットルを血球計数器にロードし、細胞を数える。24、48、および72時間後の前駆脂肪細胞の分析は、正常な細胞形態および数を示した。前駆脂肪細胞のアジポジェニック誘導は、脂肪滴の急速な分化および蓄積を示した。
単離中の前駆脂肪細胞の積極的な取り扱いは、細胞損傷および低い細胞数をもたらした。予防措置を講じているにもかかわらず、微生物汚染を観察することができます。オイルレッドOによる脂質染色は、前駆脂肪細胞が脂肪生成誘因下で脂肪滴を急速に発達し始め、蓄積が24、48、および72時間で観察されるように経時的に進行することを示した。
細胞数に対する脂質蓄積を、脂質およびDNA染色剤を用いて定量した。脂質蓄積および細胞増殖の両方が、時間の経過とともに増加した。低い細胞数または損傷した細胞は、組織画分があまりにも長く消化されるときに観察され得る。
したがって、1時間半の消化を超えないようにすることをお勧めします。単離された前駆脂肪細胞は、遺伝子発現研究に使用することができる。cDNA合成およびそれに続くqPCRまたはRNAseqに使用するのに十分なRNAを得ることができる。
