提示されたプロトコルは非常に簡単であり、研究者が一次副腎培養を準備するのに役立ちます。これは、副腎ステロイド新生を開始するための簡単な手順を提供します.この技術は、ストレス関連疾患のスクリーニングに適用され得る、薬剤阻害された炎症反応のすべての可能性。
この手順のデモンストレーションは、私の研究室の修士課程の学生、ウェイ・チャン・リーです。70%エタノールを使用して安楽死SDラットを殺菌し、皮膚に吸収させることから始めます。ティッシュペーパーで皮膚を拭いた後、ラットを上皮のきれいなプラスチック板の上に置きます。
次に、外部湾曲した鉗子を使用して、正中線で皮膚を持ち上げます。はさみを使用して、太もものレベルから肋後の角度までY形状を作成して皮膚の鈍い解剖を行います。70%エタノールでハサミをすすった後、筋肉を切断し、Y字も作り出す。
肝臓の右後ろの胃の後ろに左副腎を見つけます.標準的な鉗子と湾曲した鉗子のペアで、胃と肝臓を持ち上げ、別の湾曲した鉗子で副腎を分離し、無菌皿に入れます。細かい鉗子を使用して、各腺から副腎カプセルを慎重に移動します。
さて、組織を覆うのに十分な量の無血清DMEM F-12培地で副腎を小片にカットするために繊細なハサミを使用してください。バーナーの上にそれらを加熱することによって、3つの異なる注ぐサイズのパスツールピペットを準備します。最大の開口部を持つ最初のピペットを使用して、すべての副腎片をコラゲナーゼII.穏やかにピペットで約10回上下する培地を含む50mL円錐形チューブに移します。
その後、摂氏37度の水浴でチューブを20分間インキュベートし、5分ごとに合計4回振ります。酵素消化中に組織分散を適切に行うことは非常に重要です。2番目と最小の注ぐサイズのピペットを使用して、すべての組織片が小さくなるまでピペットとインキュベーションを繰り返します。
その後、酵素反応を停止するために摂氏4度の冷たい媒体でブレッシュの6倍のボリュームを追加します。その後、800倍Gで10分間セントラフジし、上清を2回とも廃棄する。適切な量の培地を追加し、セルを再中断します。
湿度95%、二酸化炭素5%で摂氏37度で一晩培地で成長させた所望のプレートまたは皿に細胞を植えます。翌日、細胞を無血清で温かいDMEM F-12培地で2回丁寧に洗います。新鮮な成長培地を追加し、3日目まで摂氏37度と湿度95%と二酸化炭素5%で細胞を維持します。
このプロトコルを用いて、一次培養ラット副腎細胞が得られた。3日目の副腎細胞を位相コントラスト顕微鏡で確認した。3日目培養で行った脂肪分化関連タンパク質の免疫蛍光染色は、細胞質内の小胞が脂質滴であることを確認した。
ラット副腎細胞の副腎皮質刺激ホルモン刺激後、細胞のホルモン産生能はコルチコステロンアッセイによって決定され、より高いACTH濃度でコルチコステロン放出の増加を示した。この方法は、他の一次培養システム、例えば、一次心臓培養、副腎髄質培養、エトセトラなどに適用することができる。この技術はまた、副腎皮質細胞とクロマフィン細胞との相互作用を調べるのに役立つかもしれない。
