Das vorgestellte Protokoll ist sehr einfach und wird Forschern helfen, primäre Nebennierenkulturen vorzubereiten. Es bietet ein einfaches Verfahren zum Starten von Nebennieren-Steroidogenese. Diese Technik kann auf das Screening der stressbedingten Erkrankungen angewendet werden, alle Potenziale der agentenhemmenden Entzündungsreaktionen.
Demonstriert wird das Verfahren von Wei-Chang Lee, einem Master-Studenten aus meinem Labor. Beginnen Sie mit der Sterilisation der eingeschläferten SD-Ratte mit 70% Ethanol und lassen Sie sie in die Haut aufgenommen werden. Nach dem Abwischen der Haut mit dem Tissuepapier, legen Sie die Ratte auf eine saubere Kunststoffplatte in der Supine-Position.
Als nächstes verwenden Sie externe gekrümmte Zangen, um die Haut an der Mittellinie zu heben. Verwenden Sie eine Schere, um eine stumpfe Zerlegung der Haut durchzuführen, indem Sie eine Y-Form von der Höhe des Oberschenkels bis zum subcostalen Winkel erstellen. Nach dem Spülen der Schere mit 70% Ethanol, schneiden Sie den Muskel, auch eine Y-Form zu schaffen.
Finden Sie die linke Nebenniere hinter dem Magen in der rechten hinter der Leber. Mit einem Paar Standardzange und einem Paar gekrümmter Zange, heben Sie den Magen und die Leber und isolieren Sie dann die Adrenale mit einer anderen gekrümmten Zange und legen Sie sie in eine sterile Schale. Verwenden Sie feine Zange, um die Nebennierenkapsel vorsichtig aus jeder Drüse zu bewegen.
Verwenden Sie nun eine zarte Schere, um die Nebennieren in kleine Stücke in genügend Menge an serumfreiem DMEM F-12 Medium zu schneiden, um das Gewebe zu bedecken. Bereiten Sie drei verschiedene Gießgröße Pasteur Pipetten vor, indem Sie sie über einen Brenner erhitzen. Verwenden Sie die erste Pipette mit der größten Öffnung, um alle Nebennierenstücke in ein 50ml konisches Rohr zu übertragen, das Medium mit Collagenase II.Gently Pipette die Gewebestücke auf und ab etwa 10 mal.
Dann bebrüten Sie die Röhre in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für zwanzig Minuten, und schütteln Sie es alle fünf Minuten, insgesamt viermal. Es ist sehr wichtig, die Gewebedispersion während der Enzymverdauung richtig durchzuführen. Verwenden Sie die zweite und dann die kleinste Rohrleitung in Gießgröße, um pipettierende und inkubale Pipetten zu wiederholen, bis alle Gewebestücke kleiner werden.
Dann fügen Sie sechsfache Volumen von Bresh in vier Grad Celsius kaltem Medium, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Dann Zentrifuge bei 800 mal G für 10 Minuten, und entsorgen Sie den Überstand beide Male. Fügen Sie ein entsprechendes Medium-Volumen hinzu, und setzen Sie die Zellen erneut aus.
Pflanzen Sie die Zellen in gewünschte Teller oder Geschirr mit gewachsenen Medium über Nacht bei 37 Grad Celsius in 95% Luftfeuchtigkeit und 5% Kohlendioxid. Am nächsten Tag die Zellen zweimal mit serumfreiem, warmem DMEM F-12 Medium vorsichtig waschen. Fügen Sie frisches Wachstumsmedium hinzu und halten Sie die Zellen bis zum 3. Tag bei 37 Grad Celsius und 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % Kohlendioxid.
Mit diesem Protokoll wurden primäre kultivierte Nebennierenzellen der Ratte erhalten. Tag 3 Nebennierenzellen wurden unter einem Phasenkontrastmikroskop bestätigt. Immunfluoreszenzfärbung von Fettdifferenzierungsproteinen, die an Tag-3-Kulturen durchgeführt wurden, bestätigten, dass Vesikel innerhalb des Zytoplasmas Lipidtröpfchen sind.
Nach der adrenocorticotropen Hormonstimulation der Nebennierenzellen der Ratte wurde die hormonproduzierende Fähigkeit der Zellen durch Corticosteron-Assay bestimmt, was eine erhöhte Corticosteron-Freisetzung mit höherer ACTH-Konzentration zeigte. Diese Methode kann auf andere primäre Kultursysteme angewendet werden, wie primäre Herzkulturen, Nebennieren-Medulla-Kulturen, et cetera. Diese Technik kann auch helfen, die Interaktion zwischen adrenocortischen Zellen und Chromaffinzellen zu untersuchen.
