البروتوكول المقدم سهل جداً وسيساعد الباحثين على إعداد الثقافات الكظرية الأولية. ويوفر إجراء سهل لبدء تولد الستيرويد الكظرية. يمكن تطبيق هذه التقنية على فحص الأمراض المرتبطة بالإجهاد ، وجميع إمكانات الاستجابات الالتهابية التي تمنعها العوامل.
إثبات الإجراء سيكون (وي شانغ لي)، طالب ماجستير من مختبري. تبدأ تعقيم القتل الرحيم SD الفئران باستخدام 70٪ الإيثانول والسماح لها أن تمتص في الجلد. بعد مسح الجلد بورق الأنسجة ، ضع الجرذ على طبق بلاستيكي نظيف في موضعه.
بعد ذلك، استخدم ملقطًا منحنيًا خارجيًا لرفع الجلد عند خط الوسط. استخدام مقص لإجراء تشريح حاد من الجلد عن طريق خلق شكل Y من مستوى الفخذ إلى زاوية تحت سطحية. بعد شطف مقص مع 70٪ الإيثانول، وقطع العضلات، وخلق أيضا شكل Y.
حدد مكان الغدة الكظرية اليسرى خلف المعدة في الحق خلف الكبد. مع زوج من ملقط القياسية وزوج من ملقط المنحني، ورفع المعدة والكبد ومن ثم عزل الغدة الكظرية مع ملقط منحنية أخرى ووضعها في طبق معقمة. استخدام ملقط غرامة لنقل بعناية كبسولة الكظرية من كل غدة.
الآن، استخدم زوج دقيق من مقص لقطع الغدة الكظرية إلى قطع صغيرة في كمية كافية من المصل خالية DMEM F-12 المتوسطة لتغطية الأنسجة. إعداد ثلاثة مختلف صب حجم الماصات البسترة عن طريق تسخين لهم على الموقد. استخدام ماصة الأولى مع أكبر فتح لنقل جميع قطع الكظرية في أنبوب مخروطي 50mL تحتوي على المتوسطة مع كولاجيناز II.Gently pipette قطع الأنسجة صعودا وهبوطا حوالي 10 مرات.
ثم احتضان الأنبوب في حمام مائي في 37 درجة مئوية لمدة عشرين دقيقة، وهز كل خمس دقائق، أربع مرات في المجموع. من الأهمية بمكان إجراء تشتت الأنسجة بشكل صحيح أثناء هضم الإنزيم. استخدام الثانية ثم أصغر صب الحجم ماصة لتكرار الأنابيب والاحتضان حتى تصبح جميع قطع الأنسجة أصغر.
ثم إضافة ستة أضعاف حجم من bresh في أربع درجات مئوية متوسطة الباردة لوقف رد فعل انزيمي. ثم في المركز 800 مرات G لمدة 10 دقائق، والتخلص من افرا في كلتا المرتين. إضافة وحدة تخزين مناسبة من المتوسط، وإعادة تعليق الخلايا.
زرع الخلايا في لوحات أو أطباق المرجوة مع نمت المتوسطة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في رطوبة 95٪و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي، قم بغسل الخلايا بعناية مرتين مع 12-12 DMEM الخالية من المصل. إضافة متوسطة النمو الطازجة والحفاظ على الخلايا في 37 درجة مئوية و 95٪ الرطوبة و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى اليوم 3.
وباستخدام هذا البروتوكول، تم الحصول على خلايا الغدة الكظرية المستزرعة الأولية. تم تأكيد الخلايا الغدية في اليوم الثالث تحت مجهر النقيض من المرحلة. تلوين من التمايز الدهنية التي أجريت في الثقافات يوم 3 أكد أن vesicles داخل السيتوبلازم هي قطرات الدهون.
بعد التحفيز هرمون adrenocorticotropic من خلايا الغدة الكظرية الفئران, تم تحديد القدرة على إنتاج الهرمونات من الخلايا من قبل المقايسة كورتيكوستيرون, تظهر زيادة إطلاق الكورتيكوستيرون مع تركيز أعلى ACTH. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أنظمة الثقافة الأولية الأخرى، مثل الثقافات القلبية الأولية، وثقافات النخاع الكظري، وما إلى ذلك. قد تساعد هذه التقنية أيضًا في التحقق من التفاعل بين الخلايا الكظرية والخلايا الكرومفينية.
