O protocolo apresentado é muito fácil e ajudará os pesquisadores a preparar culturas suprarrenais primárias. Ele fornece um procedimento fácil para iniciar a esterilnese adrenal. Esta técnica pode ser aplicada na triagem das doenças relacionadas ao estresse, todos os potenciais das respostas inflamatórias inibidas pelo agente.
Demonstrando o procedimento estará Wei-Chang Lee, um estudante de mestrado do meu laboratório. Comece esterilizando o rato SD de tamanho eutanizado usando 70% de etanol e deixando-o ser absorvido na pele. Depois de limpar a pele com o papel de tecido, coloque o rato sobre uma placa de plástico limpa na posição supina.
Em seguida, use fórceps curvos externos para levantar a pele na linha média. Use a tesoura para realizar uma dissecção contundente da pele, criando uma forma Y do nível da coxa até o ângulo subcostal. Depois de enxaguar a tesoura com 70% de etanol, corte o músculo, criando também uma forma Y.
Localize a glândula suprarrenal esquerda atrás do estômago na direita atrás do fígado. Com um par de fórceps padrão e um par de fórceps curvos, levante o estômago e o fígado e, em seguida, isole as suprarrenais com outra fórceps curvas e coloque-as em um prato estéril. Use fórceps finos para mover cuidadosamente a cápsula adrenal de cada glândula.
Agora, use um delicado par de tesouras para cortar as suprarrenais em pequenos pedaços em quantidade suficiente de meio DMEM F-12 sem soro para cobrir o tecido. Prepare três pipetas pasteur de tamanho de derramamento diferentes aquecendo-as sobre um queimador. Use a primeira pipeta com a maior abertura para transferir todas as peças suprarrenais em um tubo cônico de 50mL contendo meio com Collagenase II.Pipeta suavemente os pedaços de tecido para cima e para baixo cerca de 10 vezes.
Em seguida, incubar o tubo em um banho de água a 37 graus Celsius por vinte minutos, e sacudi-lo a cada cinco minutos, quatro vezes no total. É muito crítico realizar adequadamente a dispersão tecidual durante a digestão da enzima. Use a segunda e, em seguida, a menor pipeta do tamanho de derramamento para repetir a pipetação e a incubação até que todos os pedaços de tecido se tornem menores.
Em seguida, adicione o volume de seis vezes de bresh em quatro graus Celsius meio frio para parar a reação enzimática. Em seguida, centrafuge a 800 vezes G por 10 minutos, e descarte o supernatante em ambas as vezes. Adicione um volume adequado de meio e suspenda as células.
Plante as células em pratos ou pratos desejados com meio cultivado durante a noite a 37 graus Celsius em 95% de umidade e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, lave cuidadosamente as células duas vezes com meio DMEM F-12 quente e sem soro. Adicione meio de crescimento fresco e mantenha as células a 37 graus Celsius e 95% de umidade e 5% de dióxido de carbono até o dia 3.
Usando este protocolo, foram obtidas células suprarrenais de ratos cultivadas primárias. As células suprarrenais do dia 3 foram confirmadas sob um microscópio de contraste de fase. A coloração imunofluorescente da proteína relacionada à diferenciação adiposa realizada no dia 3 culturas confirmaram que vesículas dentro do citoplasma são gotículas lipídicas.
Após a estimulação hormonal adrenocorticrópica de células suprarrenais de ratos, a capacidade de produção hormonal das células foi determinada pelo ensaio de corticosterona, mostrando aumento da liberação de corticosterona com maior concentração de ACTH. Este método pode ser aplicado a outros sistemas de cultura primária, como culturas cardíacas primárias, culturas de medula adrenal, etc. Esta técnica também pode ajudar a investigar a interação entre células adrenocorticas e células cromafinas.
