Представленный протокол очень прост, и это поможет исследователям подготовить первичные культуры надпочечников. Это обеспечивает легкую процедуру для начала надпочечников стероидогенез. Этот метод может быть применен при скрининге связанных со стрессом заболеваний, все потенциалы агента ингибируется воспалительных реакций.
Демонстрацией процедуры будет Вэй-Чанг Ли, студент магистратуры из моей лаборатории. Начните с стерилизации усыпанных SD крыс с использованием 70% этанола и давая ему быть поглощены в кожу. После вытирания кожи салфеткой, поместите крысу на чистую пластиковую пластину в положении лежа.
Затем используйте внешние изогнутые миппы для подъема кожи в средней линии. Используйте ножницы для выполнения тупого вскрытия кожи, создавая форму Y от уровня бедра до подречения угол. После полоскания ножницы с 70%этанола, сократить мышцы, а также создание формы Y.
Найдите левый надпочечников за желудком в правой за печенью. С парой стандартных типсов и парой изогнутых типсов поднимите желудок и печень, а затем изолируйте надпочечники с помощью другого изогнутого типса и поместите их в стерильное блюдо. Используйте тонкие типсы, чтобы тщательно переместить надпочечников капсулы из каждой железы.
Теперь используйте деликатную ножницу, чтобы разрезать надпочечники на мелкие кусочки в достаточном количестве без сыворотки DMEM F-12 среды для покрытия ткани. Подготовка трех различных залить размер пастера пипетки, нагревая их над горелкой. Используйте первую пипетку с самым большим отверстием для передачи всех надпочечников части в 50mL конической трубки, содержащей средний с Collagenase II.Gently Pipette части ткани вверх и вниз около 10 раз.
Затем инкубировать трубку в водяной бане при 37 градусов по Цельсию в течение двадцати минут, и встряхнуть его каждые пять минут, четыре раза в общей сложности. Очень важно правильно выполнять дисперсию тканей во время переваривания ферментов. Используйте второй, а затем самый маленький залить размера пипетки повторить пипетки и инкубации, пока все части ткани становятся меньше.
Затем добавьте шестикратный объем бреша в четырех градусах по Цельсию холодной среды, чтобы остановить энзиматические реакции. Затем кентрафудж в 800 раз G в течение 10 минут, и отказаться от супернатанта оба раза. Добавьте соответствующий объем среды и повторно приостановив ячейки.
Посади клетки в желаемые тарелки или посуду со выращенной средой на ночь при 37 градусах Цельсия при влажности 95% и 5%углекислом газе. На следующий день, тщательно мыть клетки дважды с сывороткой, свободной, теплой DMEM F-12 среды. Добавить свежий рост среды и поддерживать клетки на 37 градусов по Цельсию и 95%влажности и 5%углекислого газа до 3-го дня.
Используя этот протокол, были получены первичные культурные клетки надпочечников крыс. День 3 надпочечников клетки были подтверждены под фазовый контрастный микроскоп. Иммунофлюоресцентное окрашивание жировой дифференциации, связанное с белком, выполняемым на 3-й день культуры, подтвердило, что пузырьки в цитоплазме являются липидными каплями.
После адренокортикотропной гормональной стимуляции клеток крысиных надпочечников, способность клеток вырабатывать гормоны определялась анализом кортикостерона, показывая увеличение высвобождения кортикостерона с более высокой концентрацией ACTH. Этот метод может быть применен к другим системам первичной культуры, таким как первичные сердечные культуры, культуры надпочечников медуллы и так далее. Этот метод может также помочь исследовать взаимодействие между adrenocortical клетками и клетками хромаффина.
