Il protocollo presentato è molto semplice e aiuterà i ricercatori a preparare le culture surrenali primarie. Fornisce una procedura semplice per iniziare la steroidogenesi surrenale. Questa tecnica può essere applicata sullo screening delle malattie legate allo stress, tutte le potenzialità delle risposte infiammatorie inibite dall'agente.
A dimostrare la procedura sarà Wei-Chang Lee, uno studente di Master del mio laboratorio. Inizia sterilizzando il ratto SD eutanasiato usando il 70% di etanolo e lasciandolo assorbire nella pelle. Dopo aver pulito la pelle con la carta velina, posizionare il topo su una piastra di plastica pulita in posizione supina.
Quindi, utilizzare le forcep curve esterne per sollevare la pelle alla linea mediana. Utilizzare le forbici per eseguire una dissezione smussata della pelle creando una forma Y dal livello della coscia all'angolo sottocostale. Dopo aver risciacquato le forbici con il 70% di etanolo, tagliare il muscolo, creando anche una forma a Y.
Individuare la ghiandola surrenale sinistra dietro lo stomaco nella destra dietro il fegato. Con un paio di forcep standard e un paio di forcep curve, sollevare lo stomaco e il fegato e quindi isolare le surrenali con altre forcep curve e posizionarle in un piatto sterile. Utilizzare forcep fini per spostare con cura la capsula surrenale da ogni ghiandola.
Ora, usa un delicato paio di forbici per tagliare le surrenali in piccoli pezzi in una quantità sufficiente di mezzo DMEM F-12 privo di siero per coprire il tessuto. Preparare tre diverse pipette pasteur di dimensioni di versamento riscaldandole su un bruciatore. Utilizzare la prima pipetta con la più grande apertura per trasferire tutti i pezzi surrenali in un tubo conico da 50 ml contenente mezzo con Collagenasi II.Pipettare delicatamente i pezzi di tessuto su e giù circa 10 volte.
Quindi incubare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per venti minuti e scuoterlo ogni cinque minuti, quattro volte in totale. È molto fondamentale eseguire correttamente la dispersione dei tessuti durante la digestione enzimatica. Utilizzare il secondo e quindi la pipetta pour-size più piccola per ripetere la pipettazione e l'incubazione fino a quando tutti i pezzi di tessuto diventano più piccoli.
Quindi aggiungere sei volte il volume di bresh in quattro gradi Celsius mezzo freddo per fermare la reazione enzimatica. Quindi centrafuge a 800 volte G per 10 minuti, e scartare il supernatante entrambe le volte. Aggiungere un volume appropriato di supporto e sospendere di nuovo le celle.
Piantare le cellule in piatti o piatti desiderati con mezzo coltivato durante la notte a 37 gradi Celsius in 95% di umidità e 5% di anidride carbonica. Il giorno seguente, lavare accuratamente le cellule due volte con un mezzo DMEM F-12 caldo e privo di siero. Aggiungere un mezzo di crescita fresco e mantenere le cellule a 37 gradi Celsius e 95% di umidità e 5% di anidride carbonica fino al giorno 3.
Utilizzando questo protocollo, sono state ottenute cellule surrenali primarie coltivate a ratto. Le cellule surrenali del giorno 3 sono state confermate al microscopio a contrasto di fase. La colorazione immunofluorescente della proteina correlata alla differenziazione adiposa eseguita nelle colture del giorno 3 ha confermato che le vescicole all'interno del citoplasma sono goccioline lipidiche.
Dopo la stimolazione dell'ormone adrenocorticotropo delle cellule surrenali del ratto, la capacità di produzione ormonale delle cellule è stata determinata dal saggio del corticosterone, mostrando un aumento del rilascio di corticosterone con una maggiore concentrazione di ACTH. Questo metodo può essere applicato ad altri sistemi di coltura primaria, come colture cardiache primarie, colture di midollo surrenale, eccetera. Questa tecnica può anche aiutare a studiare l'interazione tra cellule adrenocorticali e cellule cromaffini.
