Le protocole présenté est très facile et il aidera les chercheurs à préparer les cultures surrénales primaires. Il fournit une procédure facile pour commencer la steroidogenèse surrénale. Cette technique peut être appliquée sur le dépistage des maladies liées au stress, tous les potentiels des réponses inflammatoires inhibées par l’agent.
Wei-Chang Lee, étudiant à la maîtrise de mon laboratoire, démontrera la procédure. Commencez par stériliser le rat SD euthanasié à l’aide de 70 % d’éthanol et laissez-le être absorbé dans la peau. Après avoir essuyé la peau avec le papier de soie, placez le rat sur une plaque de plastique propre en position supine.
Ensuite, utilisez des forceps incurvés externes pour soulever la peau à la ligne médiane. Utilisez des ciseaux pour effectuer une dissection émoussée de la peau en créant une forme Y du niveau de la cuisse à l’angle subcostal. Après avoir rincer les ciseaux avec 70% d’éthanol, couper le muscle, également la création d’une forme Y.
Localiser la glande surrénale gauche derrière l’estomac dans la droite derrière le foie. Avec une paire de forceps standard et une paire de forceps incurvés, soulevez l’estomac et le foie, puis isolez les surrénales avec un autre forceps incurvé et placez-les dans un plat stérile. Utilisez des forceps fins pour déplacer soigneusement la capsule surrénale de chaque glande.
Maintenant, utilisez une délicate paire de ciseaux pour couper les surrénales en petits morceaux en quantité suffisante de sérum sans DMEM F-12 moyen pour couvrir le tissu. Préparer trois pipettes pasteur de taille de coulée différentes en les chauffant au-dessus d’un brûleur. Utilisez la première pipette avec la plus grande ouverture pour transférer tous les morceaux surrénales dans un tube conique de 50mL contenant le milieu avec Collagenase II.Gently Pipette les morceaux de tissu vers le haut et vers le bas environ 10 fois.
Puis incuber le tube dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant vingt minutes, et le secouer toutes les cinq minutes, quatre fois au total. Il est très essentiel d’effectuer correctement la dispersion des tissus pendant la digestion des enzymes. Utilisez la deuxième pipette, puis la plus petite pipette de taille pour répéter le pipetage et l’incubation jusqu’à ce que tous les morceaux de tissu deviennent plus petits.
Ajoutez ensuite six fois le volume de bresh dans le milieu froid de quatre degrés Celsius pour arrêter la réaction enzymatique. Puis centrafuge à 800 fois G pendant 10 minutes, et jeter le supernatant les deux fois. Ajouter un volume approprié de milieu, et re-suspendre les cellules.
Plantez les cellules dans les assiettes désirées ou les plats cultivés à feu moyen pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans 95% d’humidité et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, lavez soigneusement les cellules deux fois à l’moyen DMEM F-12 sans sérum et chaud. Ajouter le milieu de croissance frais et maintenir les cellules à 37 degrés Celsius et 95% d’humidité et 5% de dioxyde de carbone jusqu’au jour 3.
Utilisant ce protocole, les cellules surrénales de rat cultivé primaire ont été obtenues. Des cellules surrénales de jour 3 ont été confirmées sous un microscope de contraste de phase. La coloration immunofluorescente de la protéine liée à la différenciation adipeux effectuée le jour 3 cultures a confirmé que les vésicules dans le cytoplasme sont des gouttelettes lipidiques.
Après stimulation d’hormone adrenocorticotropic des cellules surrénales de rat, la capacité hormone-productrice des cellules a été déterminée par l’essai de corticosterone, montrant la libération accrue de corticosterone avec la concentration plus élevée d’ACTH. Cette méthode peut être appliquée à d’autres systèmes de culture primaire, tels que les cultures cardiaques primaires, les cultures médullaires surrénales, et cetera. Cette technique peut également aider à étudier l’interaction entre les cellules adrenocorticales et les cellules de chromaffine.
