El protocolo presentado es muy fácil y ayudará a los investigadores a preparar cultivos suprarrenales primarios. Proporciona un procedimiento fácil para iniciar la esteterogénesis suprarrenal. Esta técnica se puede aplicar en el cribado de las enfermedades relacionadas con el estrés, todas las potencialidades de las respuestas inflamatorias inhibidas por el agente.
Demostrando el procedimiento estará Wei-Chang Lee, un estudiante de maestría de mi laboratorio. Comience por esterilizar rata SD eutanizada usando 70%etanol y dejando que se absorba en la piel. Después de limpiar la piel con el papel tisú, coloque la rata en una placa de plástico limpia en la posición supina.
A continuación, utilice fórceps curvos externos para levantar la piel en la línea media. Utilice tijeras para realizar una disección contundente de la piel mediante la creación de una forma Y desde el nivel del muslo hasta el ángulo subcostal. Después de enjuagar las tijeras con 70%etanol, cortar el músculo, también creando una forma Y.
Localice la glándula suprarrenal izquierda detrás del estómago en la derecha detrás del hígado. Con un par de fórceps estándar y un par de fórceps curvos, levante el estómago y el hígado y luego aísle las suprarrenales con otros fórceps curvos y colóquelos en un plato estéril. Utilice fórceps finos para mover cuidadosamente la cápsula suprarrenal de cada glándula.
Ahora, usa un delicado par de tijeras para cortar las glándulas suprarrenales en trozos pequeños en suficiente cantidad de medio DMEM F-12 libre de suero para cubrir el tejido. Prepare tres pipetas pasteur de diferentes tamaños de vertido calentándolas sobre un quemador. Utilice la primera pipeta con la abertura más grande para transferir todas las piezas suprarrenales a un tubo cónico de 50 ml que contenga un medio con Colagenasa II.Pipetear suavemente las piezas de tejido hacia arriba y hacia abajo unas 10 veces.
Luego incuba el tubo en un baño de agua a 37 grados celsius durante veinte minutos, y agitarlo cada cinco minutos, cuatro veces en total. Es muy crítico realizar correctamente la dispersión del tejido durante la digestión enzimática. Utilice la segunda y luego la pipeta de tamaño vertido más pequeña para repetir la pipeteo y la incubación hasta que todas las piezas de tejido se vuelvan más pequeñas.
A continuación, agregue seis veces el volumen de bresh en cuatro grados Celsius medio frío para detener la reacción enzimática. A continuación, centrafuge a 800 veces G durante 10 minutos, y desechar el sobrenadante ambas veces. Agregue un volumen adecuado de medio y vuelva a suspender las celdas.
Plantar las células en platos o platos deseados con medio cultivado durante la noche a 37 grados celsius en 95% de humedad y 5% dióxido de carbono. Al día siguiente, lave cuidadosamente las células dos veces con un medio DMEM F-12 cálido y sin suero. Añadir medio de crecimiento fresco y mantener las células a 37 grados celsius y 95% de humedad y 5% dióxido de carbono hasta el día 3.
Usando este protocolo, se obtuvieron células suprarrenales de ratas cultivadas primarias. Las células suprarrenales del día 3 se confirmaron bajo un microscopio de contraste de fase. La tinción inmunofluorescente de la proteína relacionada con la diferenciación adiposa realizada en el día 3 los cultivos confirmaron que las vesículas dentro del citoplasma son gotas de lípidos.
Después de la estimulación de la hormona adrenocorticotrópica de las células suprarrenales de rata, la capacidad de producción hormonal de las células se determinó mediante un ensayo de corticosterona, mostrando una mayor liberación de corticosterona con mayor concentración de ACTH. Este método se puede aplicar a otros sistemas de cultivo primario, como cultivos cardíacos primarios, cultivos de médula suprarrenal, etc. Esta técnica también puede ayudar a investigar la interacción entre las células adrenocorticales y las células de la cromafina.
