この方法は、CD11c陽性樹状細胞の研究や高血圧傷害の役割を増強する方法を含む高血圧および心血管疾患の分野における重要な質問に答えることができる。この技術の主な利点は、固体器官からのCD11c陽性樹状細胞の単離および様々な疾患状態におけるそれらの生理学的役割の研究である。したがって、このプロセスは、Bリンパ球、Tリンパ球、単球、およびマクロファージを含む複数の免疫細胞タイプに適用することができる。
この技術の可視化は、樹状細胞の単離、特にレシピエントマウスへの養子転移プロセスを理解するために重要である。始めに、70%エタノールで安楽死させたマウスの胸部および側面をスプレーする。左側で、皮膚と腹腔を慎重に開いて脾臓を露出させます。
小さな鉗子を使用して、慎重にマウスの左側に腸と肝臓を移動します。その後、小さなはさみを使用して脾臓を優しく切除します。各切除脾臓を、RPMI 1640培地の3ミリリットルを含む標識されたCチューブに入れる。
まず、コラーゲン酵素DおよびDNaseをRPMI 1640培地に加えて、脾臓消化液を調製した。Cチューブを半自動ホモジナイザーの上に置き、チューブが回転アームにしっかりと配置されていることを確認します。ホモジナイザの開始ボタンを押して、脾臓04.01プロトコルを60秒間実行します。
この後、ホモジナイザーからチューブを取り外し、連続で20rpmで37°Cで15分間インキュベートします。次に、ピペットを使用して、40マイクロメートルのストレーナーを通して濾過した後、溶液を50ミリリットルの円錐管に移します。10ミリリットルのdPBSでストレーナーを洗います。
細胞を300倍g、摂氏4度で10分間遠心分離する。その後、上清を完全に吸引し、10ミリリットルのdPBSで再懸濁してペレットを洗浄する。300 g で、摂氏 4 度で 10 分間、懸濁液を遠心分離します。
5ミリリットルのdPBSで細胞ペレットを再懸濁する。ヘモサイトメーターとトリパンブルー除外を使用して、セル数をカウントします。次の遠心分離機は300倍gで、摂氏4度で10分間細胞をペレットする。
上清を完全に吸引し、400ミリリットルの磁気活性細胞選別バッファーでペレットを再懸濁します。その後、1億個の細胞あたり100cマイクロビーズの100ミリリットルを追加します。セルの懸濁液をボルテックスし、摂氏4度の冷蔵庫で10分間インキュベートします。
この後、10ミリリットルのMACバッファーを加えて、細胞と遠心分離機を300倍gで、摂氏4度で10分間洗浄します。上清を完全に吸引し、500ミリリットルのMACバッファーで細胞を再懸濁させる。マグセパレータの磁場にLSカラムを置き、各カラムの下に15ミリリットルの円錐チューブを置き、流れを集めます。
次に、3ミリリットルのバッファーでカラムをすすいます。各列に細胞懸濁液を配置し、ラベルなしのセルを含むフローを収集します。3ミリリットルのMACsバッファでカラムを洗い、通過するラベルのない細胞を収集します。
LSカラムを1回の3ミリリットルのMACsバッファを使用して2回洗浄します。その後、磁気セパレータから LS カラムを取り外します。各カラムに5ミリリットルのMACバッファを追加し、すぐに各カラムを明確な15ミリリットルの円錐管に突っ込んで、磁気標識された細胞を洗い流します。
テキスト プロトコルで説明されているように、ヘモサイトメーターとトリパン ブルー除外を使用して、CD11c 正の DC 番号を決定します。その後、0.4%トリパンブルー溶液で1〜1希釈で細胞サンプルを希釈します。まず、テキストプロトコルで概説されているように、DC培養培地中の細胞ペレットを調製する。
DC懸濁液のピペット900マイクロリットルを24ウェル平底ファルコンプレートに。190ミリモルの最終的なナトリウム濃度のために、各ウェルに高塩DC培養培地の100マイクロリットルを追加します。プレートにラベルを付け、加湿した二酸化炭素インキュベーターを摂氏37度で48時間置きます。
48時間後、インキュベーターからプレートを取り出します。CD11c陽性DCを再中断するために、細胞培養培地を上下に1つのウェルでピペットします。
メッキされた個々のウェルごとにこれを繰り返します。300回gでチューブのすべてを遠心分離し、摂氏4度で10分間。上清を吸引し、100マイクロリットルの無菌dPBSでDCペレットを再懸濁する。
次に、チューブの1つからDC溶液を1ミリリットルのシリンジに引き込み、27ゲージの半インチ針を装備します。2%イゾフルランの下に10週齢のC57-黒-6マウスの素朴な男性を置き、安定した外科面を達成する。ペダル反射の欠如と麻酔のレベルを確認してください。
安定した外科用平面が達成されたら、ゆっくりと慎重に約30度の角度でレトロ軌道空間に針を導入する。CD11c陽性DC懸濁液をゆっくりとスムーズに注入します。注射が完了したら、眼を傷つけないように、慎重にレトロ軌道空間の針を取り外します。
次に、マウスを鼻コーンから取り出し、麻酔からの回復中に約30分間監視します。典型的な血圧分析は、低用量アンジオテンシンII注入のために移植されたDCおよび浸透性ミニポンプの採用移動に続いてここに示される。なお、この低用量のアンジオテンシンIIは、正常なマウスで血圧を上昇しないサプレッサー用量である。
正常な塩処理CD11c陽性DCを受け取るマウスは注入中に正常な血圧を維持し、高塩処理CD11c陽性DCを受けるマウスは収縮期血圧の上昇を示す。フローサイトメトリー分析は、次に、ここで示す格紙戦略を利用して、単離されたCD11c陽性細胞の純度を決定するために行われる。CD11c陽性細胞の増加は、総脾細胞と比較して見られる。
異なるCD11cマイクロビーズ濃度は、メーカーのプロトコルをトラブルシューティングするために利用されています。マイクロビーズの100マイクロリットルを使用する脾細胞の磁気分離は、CD11c陽性細胞の約65%を生み出し、200マイクロリットルを使用すると55%を生み出し、300マイクロリットルを使用すると50%のFcRブロッカーが100マイクロビーズと共に含まれる。磁気分離の後、FcRの遮断は約65%のCD11c陽性細胞を生み出す。
その後、一部の脾細胞は100マイクロビーズでインキュベートされ、LSカラムを介して磁気的に分離されます。分離された細胞は、CD11cの追加100マイクロリットルでインキュベートされ、LSカラムを介して再び分離される。この二重分離プロセスは、92%CD11c陽性細胞を生み出した。
この手順を試みる場合、細胞細胞量測定フローにより単離された細胞の純度を確認することが重要である。樹状細胞の磁気分離後、タンパク質および単一細胞シーケンシングを含む分子技術によって活性化状態を決定するために培養することができる。その発展以来、高血圧における樹状細胞の機能と特定の役割を研究することが可能になりました。
研究者は現在、高血圧の特定抗原を探求しています。
