血管周囲脂肪組織は血管を取り囲み、心血管生理を調節します。このプロトコルは、血管微小環境におけるヒト脂肪前駆体の機能に関連する主要な質問に答えるために使用される。脂肪前駆細胞は、解剖学的位置によって変化する。
我々は、多能性前駆物質の集団が心血管疾患患者から血管内脂肪組織から正常に誘導できることを示す。手順を実証することは、私の研究室の医学生であるスペンサー・スコットです。テキストプロトコルに記載されているように、手術室からヒト血管内脂肪組織またはPVATの500ミリグラムの部分を取得します。
新鮮なヒトPVATをDMEMから25ミリリットルの抗生物質溶液を含む50ミリリットルの円錐管に移す。摂氏4度で20分間ロッキングでインキュベートします。PVATが抗生物質溶液にある間、摂氏37度で解離緩衝液のアリコートを解凍する。
50マイクロリットルの抗生物質/抗ミキサイト溶液を5ミリリットルの解離バッファーに加え、0.22ミクロンのシリンジフィルターを使用して滅菌します。24ウェルプレートの1つの井戸にゼラチン溶液を1ミリリットル加えます。薄層流れフードでは、滅菌鉗子とはさみを使用して、抗生物質溶液から無菌ペトリ皿にPVATを移します。
組織に予温解離バッファーの 1 ミリリットルを追加します。.滅菌鉗子と解剖はさみを使用して、組織全体をスラリーに細かくミンチします。1ミリリットルのスラリーを4ミリリットルの解離バッファーに移します。
200 rpm で摂氏37度の軌道シェーカーで、側面のチューブを1時間インキュベートします。1時間後、目に見える組織片が存在しなく、溶液が曇った細胞懸濁液として現れる。50ミリリットルの円錐チューブの上に設定された70ミクロンの細胞ストレーナーを介して溶液をフィルタリングします。
できるだけ多くの細胞を捕捉するために、抗生物質溶液の追加10ミリリットルでストレーナーをリンスします。ストレーナーを絞らない。今度は、振るバケツ遠心分離機で300回gで12分間細胞をペレット化する。
遠心分離後、チューブは脂肪細胞の脂肪の上層、相間およびペレットに分離される。ペレットは、内皮細胞、免疫細胞、血液細胞および前駆細胞を含む間質血管分率である。ペレットをHBSSと遠心分離機の10ミリリットルで300倍gで5分間再懸濁します。
HBSS での合計 2 回のスッシュに対してこの手順を繰り返します。今、24ウェルプレートからゼラチンを吸引します。HBSSで井戸を1回静かに洗い、バインドされていないゼラチンを取り除きます。
成長培地の1ミリリットルの赤血球とゼラチンコーティングウェルに種子を含む間質血管分画ペレットを再懸濁します。次に、培地中の培地に1ミリリットル当たり25ナノグラムの最終的な濃度にヒトFGF2を加える。5%CO2で摂氏37度で24時間インキュベートします。
細胞を24時間増殖させた後、増殖培地を取り出し、HBSSで5回洗浄します。この洗浄ステップは、赤血球および死んだ細胞を除去する。その後、新鮮な成長培地の1ミリリットルを追加します 25 各ウェルにミリリットルFGF2あたりナノグラム.
毎回1ミリリットル新鮮なFGF2あたり25ナノグラムで補うことを確認するために48時間ごとにメディアを変更します。通過細胞は、外植から7~10日後に100%合流に達すると。これを行うには、成長培地を吸引し、1ミリリットルHBSSで単層を2回洗浄する。
ウェルからすべてのHBSSを吸引し、細胞解離溶液の数滴を追加します。プレートを数回タップして渦巻き、5%CO2で摂氏37度で5〜7分間インキュベートし、細胞を持ち上げます。次に、分離した細胞に約1ミリリットルの新鮮な培養培地を加える。
500マイクロリットルの成長培地と25ナノグラムのFGF2を含む24ウェルプレートの2つの井戸に、取り外された細胞の500マイクロリットルを分配します。また、ヒト骨髄間葉系幹細胞またはMSCコロニーの培養は、テキストプロトコルに記載されている。12ウェルプレートのウェルごとに骨髄およびPVAT由来細胞の適切な数をプレートします。
小児性および骨形成状態の場合、ウェルあたり約200,000〜225,000個の細胞をプレートします。一方、軟骨形成状態に対して、プレート150,000〜175,000細胞当たり175,000個の細胞。次に、細胞剥離液を添加することにより、ヒトPVAT前駆細胞集団およびヒト骨髄MSC集団の両方から細胞を解離する。
剥離液中の細胞を摂氏37度、5%CO2で5分間インキュベートします。別々の15ミリリットル円錐バイアルに集団を引っ張ります。バイアルを500倍gで7分間回転させ、細胞をペレットにします。
その後、PBSの1ミリリットルで細胞を再懸濁し、ヘモサイトームを使用して細胞数を推定する。以前のように12ウェル皿に細胞を盛り付けます。誘発および非誘導の浸食および骨形成状態のための別々の皿を提供する。
そして、誘発された状態の各ウェルに1.5ミリリットルの有数および骨形成伝導媒体を加える。その後、非誘発状態の各ウェルに1.5ミリリットルの有量および骨形成性非誘導培地を加える。37°Cおよび5%CO2で、有数および骨形成性の誘導および非誘導細胞集団のインキュベーションを開始する。
ヒトPVAT前駆細胞およびヒト骨髄MCの残量を500倍gで7分間スピンダウンします。残りの骨髄およびPVAT由来の細胞ペレットを再懸濁して、10マイクロリットル当たり100,000細胞の密度を達成するために必要な体積を決定します。次に、軟骨系系統誘導のためのMSC成長培地の計算された体積中のペレットを再懸濁する。
ピペットを使用して細胞の体積を上下に静かに動かして、均質な分布を確保します。今ピペット濃縮細胞溶液の10マイクロリットルの液滴を各ウェルの中心に入れて、100,000個の細胞のマイクロ質量を形成する。蒸発を防ぐために、隣接する井戸に1ミリリットルの滅菌水を入れます。
マイクロマスを37°C、5%CO2で2時間培養し、マイクロマスを凝集させます。2時間後、誘導された状態の各ウェルに、1ミリリットルのヒトTGF-β-1当たり10ナノグラムでスパイクした軟骨発生分化培地を慎重に添加する。今慎重に非誘導培地の1.5ミリリットルを非誘導状態の井戸に加える。
テキストプロトコルに記載されているようにサンプルを脱水、埋め込み、染色するために、誘導された軟骨発生状態のマイクロ質量をカセットに擦り付けたり、注いだりします。アディポジェニック分化研究は、ヒト骨髄由来MSCおよびPVAT由来前駆細胞と並行して行った。非誘導状態では、脂質蓄積は明らかでない。
これは、油赤Oを用いた中性脂質の染色後に示される誘導状態とは対照的であるが、ヒト大動脈PVAT由来細胞における分化の程度はより強いが、ヒト細胞源はいずれも脂肪系系統について分化する能力を示した。骨形成分化プロトコルは、ヒト骨髄由来のMSCおよびPVAT由来細胞に使用された。非誘導細胞はアリザリンレッドで染色しなかった。
骨形成分化プロトコルの後、ヒトMSPはアリザリンレッドで染色された石灰化結節を開発したが、ヒト大動脈PVAT細胞は染色しなかった。ヒト骨髄MSCとヒトPVATの両方に由来する細胞は、微量のコラーゲン蓄積を伴う軟骨発生分化の特徴を示す。ヒト骨髄MCsおよび大動脈PVAT由来細胞から形成された微量は、アルシアンブルー染色で示されるように糖アミノグリカンの豊富な蓄積も示した。
形態学的には、ラクナエに似た構造が、コラーゲン沈着に囲まれた空洞に座っている細胞で検出された。酵素的解離の前に血管内脂肪組織を細かくミンチし、各系統分化アッセイに適切な細胞密度をメッキすることが重要です。この手順に従って、ウェスタンブロットおよびフローサイトメトリーと組み合わせた定量PCRを使用して、血管内脂肪および骨髄源からの分化前駆物質の系統特異的マーカーを特徴付けるべきである。
この技術により、肥満時に血管内脂肪組織の拡張と機能不全を調節するメカニズムと、前駆細胞が血管機能や心血管疾患に及ぼす影響を理解し始めることができます。
