当社のプロトコルは、RNA-Seqとバイオ情報学的ツールを利用して、茎のような大腸腫瘍球の形成に寄与する過剰発現ドライバー遺伝子を迅速に明らかにしました。このプロトコルは、選択的大腸癌における癌幹細胞の分子機構を調べる、微分発現遺伝子およびシグナル経路をスクリーニングするために使用される。培養7日目には、デジタル細胞イメージングシステムを備えた反転顕微鏡を使用して、腫瘍球の直径を観察し、測定します。
腫瘍球が直径100マイクロメートル以上に達したら、0.25%トリプシンで培養を治療する。摂氏37度で5分後、トリプシンを成長培地の2倍の体積で中和し、ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。遠心分離によって細胞を収集します。
そして、ペレットを培地濃度の100マイクロリットル当たり4細胞に5倍10回で再懸濁する。各チューブに目的の一次抗体の2マイクロリットルを加え、室温で30分間、毎分200回転で細胞をインキュベートします。インキュベーションの最後に、各チューブを900マイクロリットルのPBSで洗浄し、標準的なプロトコルに従ってフローサイトメトリーによって目的のタンパク質の発現のために細胞を分析します。
ちょうど実証したようにトリプシンの採取後のRNA分離のために、PBS濃度の50マイクロリットルあたり2倍10〜5番目の細胞で細胞を再懸濁し、各サンプルをチューブ当たり2マイクロリットルのベータメルカプトエタノールを添加した200マイクロリットルの溶菌緩衝液で溶菌する。短い渦を室温で5分間インキュベーションした後、遠心分離によってライセートを収集し、各チューブに70%エタノールの200マイクロリットルを加えます。サンプルを急速なカラムに移し、遠心分離により溶媒を除去します。
400マイクロリットルの洗浄液1と600マイクロリットルの洗浄液2でサンプルを洗浄し、遠心分離によって非RNAを完全に除去し、続いて同じ遠心分離条件下でさらに2分間遠心分離を行い、残留エタノールを除去します。その後、ペレットをチューブあたり50マイクロリットルの蒸留水で再懸濁し、サンプルを遠心分離してから、上清を含むRNAを採取します。RNAシーケンシング解析後の親腫瘍細胞と比較した腫瘍球細胞間の遺伝子発現の差動を調べた。
腫瘍球および親グループで100を超える読み取りカウントを持つ1からマイナス1 log2の折り返し変化を有する遺伝子を選択する。そして、指示に示されたコマンドを使用します。データの火山プロットを得て、遺伝子の発現の差を求める。
ネットワーク解析での駆動遺伝子選択では、単一の遺伝子入力を選択し、選択した過発現遺伝子を、生物として指定し、公認遺伝子シンボルをIDタイプとして指定して貼り付けます。[アップロード] をクリックして続行します。タンパク質とタンパク質の相互作用を用いてデータを挿入して分析するには、遺伝的タンパク質とタンパク質の相互作用に続き、900の信頼度スコアを遮断したSTRING interactomeデータベースを使用して、種子遺伝子を示す。
アップロードされた遺伝子を架橋する。より多くの個々の遺伝子と関連付ける種子遺伝子は、腫瘍球の形成を維持することに関与し得るドライバ遺伝子として選択することができる。[背景] のマッピング概要の白で [続行] を選択し、[レイアウト] ノブで [アトラスを強制] を選択します。
次に、パンサー塩基対を選択して、アップレギュレーション遺伝子群を解析します。培養から7日以内に直径100マイクロメートルを超える腫瘍球体が形成される。フローサイトメトリック解析は、親のHT29細胞と比較して、HT29由来の腫瘍球におけるLGR5およびCD133発現の増加を明らかにする。
RNAシーケンシング後、ヒートマップで決定されるP値が0.05未満のアップまたはダウンレギュレーションの1 log2を超える遺伝子をプロットして、HT29由来の腫瘍球と親のHT29細胞の間の有意な遺伝子を区別することができます。本代表的な実験では、1つのlog2を超えるアップレギュレート遺伝子の分析は、10種の遺伝子をもたらし、遺伝子ネットワークを架橋した。パンサー塩基対分析は、2つの遺伝子がアポトーシスの陰性調節と関連していることを示した。
さらに、選択された遺伝子は、結果的に、HT29由来の腫瘍球における発現の増加を確認する定量PCRによって検証された。遺伝子の差動選択は、手順の最も重要なステップです。1 より大きい log2 の折り返し変更を使用し、再集計が 100 を超える条件として使用してください。
このプロトコルを使用すると、大腸由来の腫瘍球から選択された遺伝子を倒したり過剰発現させ、腫瘍球形成における潜在的な役割を明らかにすることができる。
