この方法で取り組みたい重要な問題は、地元の食品市場で購入した材料のRNAサンプルをバイオテクノロジー関連遺伝子のクローニングにどのように使用できるかということです。ここでは、このアプローチと潜在的なさらなる応用を実証するためのケーススタディとして、太平洋カキを使用しています。この技術の主な利点は、カキのサンプルの従来のゲノムまたはcDNAシーケンシングを回避できることです。
代わりに、シトクロムcオキシダーゼサブユニットIおよびNADHデヒドロゲナーゼの配列を、最も密接に関連する標本を選択するために、太平洋カキから公に入手可能な参照配列と比較した。この標本から調製したcDNAは、生物的に関連する遺伝子のクローニングに直接使用することができ、これは公開配列情報を使用して選択することができる。この手順のデモンストレーションは、南京農業大学グリコミクスとグリカンバイオエンジニアリング研究センターの大学院生であるヨンメイ・リュウとユクアン・リーです。
カキの組織サンプルを調製するには、滅菌メスを使用して、各カキ標本の近似幾何学的中心から約100ミリグラムの均質な軟部組織を切り取ります。50ミリリットルの液体窒素を充填したモルタルにサンプルを移します。フラッシュ冷凍カキ組織を細かい粉末に粉砕します。
各標本の凍結組織の75ミリグラムを無菌1.5ミリリットル遠心分離チューブに計量し、1ミリリットルのグアニジニウム・チオシアネート・フェノール抽出試薬と混合する。この手順の最も重要なステップは、RNA抽出ステップです。RNAの分解を最小限に抑えるためには、カキ組織の収穫とRNA抽出の間の時間を短縮することが不可欠です。
サンプルを14,000倍g、摂氏4度で15分間遠心します。上清を新しい1.5ミリリットルの遠心分離管に移し、200マイクロリットルのクロロホルムを加え、渦ミキサーで10〜15秒間完全に混ぜ合わせ、混合物が乳白色になるまで10〜15秒間混ぜます。次に、前に行った15分間遠心分離機。
200マイクロリットルピペットを使用して、上部水層を、中間相を乱すことなく慎重に新しい1.5ミリリットル遠心管に移します。500マイクロリットルのイソプロピルアルコールを遠心管に加え、穏やかに反転してサンプルを混ぜます。その後、サンプルを氷の上に20分間放置します。
14,000倍gと摂氏4度で8分間遠心分離機を使用し、上清を取り除きます。ペレットを75%エタノールの1ミリリットルに再懸濁し、遠心分離機を14,000グラム、摂氏4度で5分間再懸濁します。上清をすべて取り除き、エタノールで洗浄を繰り返します。
ペレットを室温で6分間乾燥させます。次いで、乾燥したRNAペレットを25マイクロリットルのDEPC処理水に溶解し、チューブを氷の上に置いておきます。RNAサンプルは24時間以内に使用してください。
cDNAライブラリを生成するには、まず原稿に従った溶液を添加して、300マイクロリットルPCRチューブ内の各RNAサンプルに反応混合物を調製します。抽出したRNAサンプルを1マイクロリットル加えます。PCRサーモサイクラーで混合物を摂氏42度で60分間インキュベートし、温度を摂氏95度まで5分間上げます。
生成されたcDNAライブラリをマイナス20°Cで最大12ヶ月間保存します。まず、生成されたcDNAライブラリの1マイクロリットルをPCR混合物を含むチューブに加え、原稿に従って調製する。PCRサーモサイクラーにPCRチューブを入れ、初期変性ステップと、アニーリングステップ、伸長工程、および原稿による変性ステップからなる35のPCR反応サイクルでPCR増幅を行います。
サイクル後、1回の伸長処理を5分間行います。5マイクロリットルのPCR製品を使用して、アガロースゲル電気泳動による品質を検証します。増幅されたCOX1またはND遺伝子を、それぞれ759または748塩基対のいずれかで単一のバンドとして観察する。
PCR産物の残りの部分を精製するには、各サンプルに高濃度のカオトロピック塩を含む100マイクロリットルのDNA結合バッファーを加えます。内容物を混ぜる渦。精製カラムを2ミリリットルの遠心管に入れる。
反応混合物をカラムにピペットする。取り付けられたカラムを含むチューブを遠心分離機の中に14,000倍のgで室温で1分間置きます。2ミリリットルの遠心分離管から濾液を捨て、14,000gで遠心分離機を使用して700及び400マイクロリットルの洗浄液W2で2回洗浄する。
次に、金属ブロックヒーターで1ミリリットルの脱イオン水を摂氏65度に加熱します。柱を新しい1.5ミリリットルの遠心分離管に移し、予熱した脱イオン水のピペット25マイクロリットルを白い柱膜の中心に移します。膜を室温で1分間浸します。
次いで、カラムを室温で1分間14,000回gでチューブを遠心する。カラムを廃棄し、精製PCR製品をマイナス20°Cで最大12ヶ月間保存します。必要に応じて、COX1またはNDリバースプライマーも双方向シーケンシングに使用できます。
サンガーシーケンシングの場合は、関連するCOX1またはNDフォワードプライマーを使用します。シーケンシング結果を取得した後、NCBIヌクレオチドBLASTオンラインツールを使用して、太平洋オイスター参照株のゲノム配列と配列を比較します。MgUGDおよびMgUXS遺伝子のそれぞれのフォワードおよびリバースプライマーを使用して、前述のようにPCRによって増幅および精製します。
精製PCR産物を消化バッファーでインキュベートした後、500ナノグラムのpET-30aを1.5ミリリットルの遠心分離管に溶解して、前消化したpET-30aベクターを調製し、脱イオン水を最大16マイクロリットルに加えます。次に、10倍に濃縮された消化バッファーの2マイクロリットルと20単位制限エンドヌクレアーゼNde1とXho1のそれぞれ1マイクロリットルをチューブに加えます。37°Cで3時間インキュベートします。
その後、1単位のアルカリホスファターゼを1マイクロリットル加え、摂氏37度でさらに1時間インキュベートします。次に、チューブを予熱した金属ブロックヒーターに摂氏75度で10分間置き、アルカリホスファターゼを不活性化します。MgUGDおよびMgUXS遺伝子を含む大腸菌BL21細胞を培養した後、培養液を2リットル揺動フラスコで400ミリリットルLB培地に移し、37°Cの温度で200rpmのシェーカーに置きます。
3時間後、600ナノメートルの波長で光度計の光密度を確認し、約0.5の吸収に達することを確認してください。その後、シェーカー温度を摂氏20度に下げます。400マイクロリットルの1モルIPTGを加え、組換えタンパク質の発現を3時間誘導する。
細胞を収穫した後、摂氏4度で20分間超音波処理によって細胞を破壊する。20分間、14,000回gと摂氏4度で遠心分離機を、活動試験のために新しいチューブに上清を集めます。活性アッセイの後、MgUXSおよびMgUGD混合物に20マイクロリットルのメタノールと40マイクロリットルのクロロホルムを加えることによって反応を焼き付ける。
サンプル混合物をボルテックスし、遠心分離機を14,000倍gで6分および4度摂氏化する。MALDI-TOF質量分析のための新しい管の各管の上水層を収集します。本実験では、高度に発散した標本のCOX1およびND遺伝子配列の配列アライメントを、参照太平洋カキ株と比較した。
赤い矢印は、参照配列と得られたcDNAサンプルの配列との間のヌクレオチドの違いを示す。密接に関連するカキの標本のCOX1およびND遺伝子の配列は、参照太平洋カキ株からの低い発散を示す。MALDI-TOF質量分析は、工業的に関連する遺伝子MgUGDおよびMgUXSをクローン化するためのcDNAライブラリの応用に成功したことを示す。
ゲル画像はまた、連続的に発現および精製されたMgUGDおよびMgUXSの酵素作用によって生成されるUDP-グルクロン酸およびUDP-キシロースを識別する。この方法は、参照シーケンスと得られたマーカーシーケンスとの間に完全に一致する必要はありませんし、研究者が参照されていないカキで作業する自信を与える必要があります。原則として、この方法は、密接に関連する参照種からの配列が一般に公開されている非参照生物学的サンプルに適用することができる。
この方法は、非専門家の研究者が潜在的な生物学的重要性の遺伝物質に容易にアクセスすることを可能にし、より多くの科学者が簡単にアクセスできるが不完全に同定された生物学的サンプルで作業する道を開きます。
