このプロトコルは、腸内病原体による上皮浸潤をモデル化するための幹細胞由来腸オルガノイド系の有用性と、サイトカインを用いたこのプロセスの改変を示す。マイクロインジェクションは、目的の病原体をオルガノイドの内腔に直接送達することを可能にし、生体内での感染のプロセスをより密接に複製する。この方法は、異なる腸内病原体または目的の代替サイトカインの研究に適用することができる。
私は病原体を使用する前にマイクロ注射技術を習得するためにのみフェノールレッドで手順の試験実行を完了することをお勧めします。2日目に、培地を幹細胞培地の10ミリリットルに変えて分化を開始し、成長因子を補う。6日目に、培地をRPMI-B27培地の10ミリリットルに変更し、6つのミクロモルCHIR99021に加えて、3つのミクロモルレチノイン酸を加えて、後腸への後部内臓のパターン化を開始する。
分化10日目に、後腸を基膜マトリックスに埋め込む。まず、後腸板から培地を取り出し、マグネシウムを含まないカルシウムDPPSでプレートを1回洗います。5ミリリットルのコラゲターゼ溶液をプレートに加え、摂氏37度で5分間インキュベートします。
次に、オルガノイド塩基成長培地の5ミリリットルをプレートに添加することによりコラゲターゼを不活性化する。後腸細胞はこの時点で浮いているはずです。15ミリリットルの円錐管に後腸の懸濁液を集める。
その後、240回Gで遠心分離機を1分間行う。遠心分離後、上清からピペットを取り除き、オルガノイドベース成長培地の10ミリリットルを加え、穏やかにピペットを行い、遠心分離機を95回Gで1分間再び遠心分離します。オルガノイド塩基成長培地中の細胞を2回洗浄する。
細胞を塩基成長培地の300~500マイクロリットルに再懸濁し、この溶液の約100マイクロリットルを基底膜マトリックスの1.5ミリリットルに加える。プレートヒーターに24ウェルプレートを摂氏37度に設定します。そして24ウェルプレートの1つの井戸に後腸細胞マトリックス混合物の60マイクロリットルを見つける。
簡単に設定し、顕微鏡下で密度を確認してください。マトリックスの残りの部分を24ウェルプレートに見つけた後、プレートを摂氏37度で10分間インキュベートします。その後、24ウェルプレートの各ウェルに成長因子を含む塩基成長培地の800マイクロリットルを加えます。
オルガノイドを通過するには、まずそれらから培地を取り出し、細胞持ち上げ溶液のウェルあたり500マイクロリットルに交換します。40〜50分間摂氏4度でインキュベートし、その時点でオルガノイドが溶液中に浮かんでいるべきである。オルガノイドと細胞持ち上げ溶液を15ミリリットルの円錐形チューブにそっとピペットし、オルガノイドを分解しないようにします。
オルガノイドを3〜5分間落ち着かせ、上清と単一細胞を取り除きます。オルガノイドを5ミリリットルの塩基成長培地に再懸濁し、ピペットを軽くして洗浄する。95回Gで2分間遠心分離機。
次に、ボンネット内に37°Cのプレートヒーターに24ウェルプレートを設置し、オルガノイドペレットから上清を取り除きます。次いで、P1000ピペットを用いて、オルガノイドを300~500マイクロリットルの塩基性成長培地で再懸濁し、オルガノイドを小さな塊に分解する。約100マイクロリットルのオルガノイドを基体膜マトリックスの1.5ミリリットルに入れ、ピペットを短時間混ぜ合わせます。
24ウェルプレートの1つの井戸に基膜マトリックスの60マイクロリットルを見つけます。30秒間固めるためにそれを残した後、顕微鏡の下で密度を確認してください。マトリックスの残りの部分を24ウェルプレートに見つけた後、プレートを37°Cのインキュベーターに10分間置き、原稿に従って成長因子を含む800マイクロリットルのベース成長培地でオーバーレイします。
組換えヒトIL-22プリ刺激によるマイクロインジェクションアッセイでは、培地に組換えヒトIL-22を添加し、注射の18時間前に1ミリリットル当たり100ナノグラムの最終濃度を得る。オルガノイドを含むマイクロインジェクション皿を顕微鏡のステージに積み込み、蓋を外し、オルガノイドに焦点を当て、注射を開始する準備をします。インジェクタとアームコントロールステーションをオンにします。
インジェクターが600キロパスカルの圧力と0.5秒の射出時間に設定されていることを確認します。顕微鏡の段階からまだ後退していない場合は、注入アームを回転させて確実にし、グリップヘッドを取り外します。10マイクロリットルの接種物でドリルチップをロードし、ドリルチップを鈍い端にそっと握ります。
ドリルチップをグリップヘッドに入れ、マイクロインジェクションアームに再び取り付けます。マイクロインジェクション皿の上に針が1〜2センチメートルある位置に腕をそっと動かします。腕のコントロールを使用して、針先を皿の中央に配置し、メディアの表面上に置くまで下げます。
すべての注射の後、この時点に針を返すようにアームコントロールステーションをプログラムします。オルガノイドに顕微鏡を集中させ、注入するターゲットを選択します。注射するオルガノイドのすぐ上と右側の針を置き、針を下方に動かしてオルガノイドの内腔に入れる。
マイクロインジェクターの注入ボタンを押して、フェノール染色細菌混合物を針から出てきます。そして、各オルガノイドを3回注入します。必要なオルガノイドをすべて注入したら、マイクロインジェクションプレートをステージから取り出し、蓋を交換し、プレートを摂氏37度で90分間インキュベートします。
インキュベーション後、成長培地を吸引し、3ミリリットルの細胞持ち上げ溶液に交換します。その後、摂氏4度で45分間インキュベートします。次に、オルガノイドと細胞持ち上げ溶液を、5ミリリットルのDPBSを含む15ミリリットルの円錐管に静かに移動させます。
370回Gで3分間遠心分離機。上清を取り除き、1ミリリットルのゲンタマイシン当たり0.1ミリグラムを含む塩基成長培地を1ミリリットル加える。次に、P1000を使用して、ピペットを約50回上下してオルガノイドを分解する。
4ミリリットルの培地を加え、摂氏37度で1時間インキュベートして細胞外細菌を殺す。次に、オルガノイドを370倍Gで3分間遠心分離する。上清を吸引し、できるだけ残す。
オルガノイドをDPBSで一度洗い、遠心分離機をもう一度洗います。500マイクロリットルのライシスバッファーを加え、ピペットを約50回上下して手動でヒト腸器官を解約する。室温で5分間インキュベートした後、得られた溶液をDPBSで10倍に連続して希釈する。
ピペット3つの20ミクロンの液滴は、事前に温められたLB寒天プレートにきちんとして希釈された溶液です。最後に、一晩摂氏37度でインキュベートし、コロニーカウントを進めます。ヒト腸器官をフェノール赤色細菌溶液でマイクロ注入した。
オルガノイドによるこの赤い色の保持は、重複した注射を防ぎます。組換えヒトIL-22を用いたCOF-2細胞株由来のヒト腸器官の前処理は、S.typhimurium SL1344の腸内上皮細胞への侵入を制限する。感染したオルガノイドは、宿主IEC細菌相互作用の可視化を容易にするために、免疫染色または透過電子顕微鏡のために処理された。
RNAは、感染に対するトランスクリプトーム応答を見るために注入されたオルガノイドから抽出することができる。蛍光および電子顕微鏡法はまた、宿主病原体相互作用をより詳細に観察するために使用することができる。覚えておくべきことは、マイクロインジェクターで、一貫した結果を得るために迅速かつ効率的に注射を完了できる十分な練習をしていることを確認することです。
マイクロインジェクションドリルチップは細かい鋭い点を持ち、マイクロインジェクタからロードおよびアンロードする際には注意が必要です。この技術は、上皮細胞病原体の相互作用をこれまで得られなかった詳細で研究することを可能にする。この感染モデルは、ヒト固有の病原体を研究する人に特に使用される。
