Dieses Protokoll demonstriert den Nutzen des von Stammzellen abgeleiteten Darmorganoidsystems zur Modellierung der epitheliaalen Invasion durch enterische Krankheitserreger und die Modifikation dieses Prozesses mit Zytokinen. Die Mikroinjektion ermöglicht es, den Voninteresse übertragenen Krankheitserreger direkt in die Lumenhöhle des Organoids zu geben, wodurch der Infektionsprozess in vivo genauer repliziert wird. Diese Methode könnte auf die Untersuchung verschiedener enterischer Krankheitserreger oder alternativer Zytokine von Interesse angewendet werden.
Ich würde vorschlagen, einen Testlauf des Verfahrens mit Phenolrot nur zu beenden, um die Mikroinjektionstechnik vor der Verwendung von Krankheitserregern zu meistern. Beginnen Sie am zweiten Tag mit der Differenzierung, indem Sie die Medien auf 10 Milliliter Stammzellkulturmedium umwandeln, ergänzt durch Wachstumsfaktoren. Wechseln Sie am sechsten Tag die Medien auf 10 Milliliter RPMI-B27-Medien, ergänzt durch sechs Mikromolar CHIR99021, plus drei Mikromolar-Retinsäure, um das hintere Endoderm zum Hinterdarm zu mustern.
Am Differenzierungstag 10, betten Sie das Hintergut in die Kellermembranmatrix ein. Zuerst entfernen Sie die Medien von der Hintergutplatte und waschen Sie die Platte einmal mit Calcium-Magnesium-freien DPPS. Fügen Sie fünf Milliliter Kollagenase-Lösung auf die Platte und inkubieren bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten.
Als nächstes inaktivieren Sie die Kollagenase, indem Sie der Platte fünf Milliliter des organoiden Basiswachstumsmediums hinzufügen. Die Hinterdarmzellen sollten an dieser Stelle schweben. Sammeln Sie die Hinterdarmaufhängung in einem 15-Milliliter konischen Rohr.
Dann Zentrifuge bei 240-mal-G für eine Minute. Nach der Zentrifugation, Pipette aus dem Überstand, fügen Sie 10 Milliliter der Organoid Basis Wachstumsmedien, brechen Sie das Hintergut in kleinere Stücke durch sanfte Pipetten, und Zentrifuge wieder bei 95-mal-G für eine Minute. Waschen Sie die Zellen in der Organoidbasis Wachstumsmedien zweimal.
Setzen Sie die Zellen in 300 bis 500 Mikroliter des Basiswachstumsmediums wieder auf und fügen Sie etwa 100 Mikroliter dieser Lösung zu 1,5 Millilitern der Kellermembranmatrix hinzu. Richten Sie eine 24-Well-Platte auf einer Plattenheizung bei 37 Grad Celsius ein. und erkennen Sie 60 Mikroliter der Hinterdarmzellmatrixmischung in einem Brunnen der 24-Well-Platte.
Lassen Sie es kurz einstellen und überprüfen Sie die Dichte unter dem Mikroskop. Nachdem Sie den Rest der Matrix in die 24-Well-Platte eingesehen haben, bebrüten Sie die Platte 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Dann fügen Sie 800 Mikroliter der Basis Wachstumsmedien, die Wachstumsfaktoren zu jedem Brunnen der 24-Well-Platte.
Um Organoide zu durchdringen, entfernen Sie zuerst die Medien von ihnen, und ersetzen Sie es durch 500 Mikroliter pro Brunnen der Zellhebelösung. Inkubieren Bei vier Grad Celsius für 40 bis 50 Minuten, an diesem Punkt sollten die Organoide in der Lösung schwimmen. Pipette die Organoide und die Zellhebelösung sanft in 15-Milliliter konische Röhren, versuchen, nicht die Organoide aufzubrechen.
Nachdem Sie die Organoide für drei bis fünf Minuten begleichen lassen, entfernen Sie den Überstand und die einzelnen Zellen. Die Organoide in fünf Milliliter des Basiswachstumsmediums aussetzen und sanft zum Waschen pipette. Zentrifuge bei 95-mal-G für zwei Minuten.
Als nächstes stellen Sie die 24-Well-Platte auf einer Plattenheizung bei 37 Grad Celsius in der Haube auf und entfernen Sie den Überstand aus dem Organoidpellet. Dann, mit einer P1000 Pipette, resuspendieren Sie die Organoide in 300 bis 500 Mikroliter der Basis Wachstumsmedien, um die Organoide in kleinere Stücke aufzuteilen. Ca. 100 Mikroliter der Organoide kurz in 1,5 Milliliter der Kellermembranmatrix und Pipette geben, um sie zu mischen.
Entdecken Sie 60 Mikroliter der Kellermembranmatrix in einem Brunnen der 24-Well-Platte. Nachdem Sie es 30 Sekunden lang erstarren lassen, überprüfen Sie die Dichte unter dem Mikroskop. Nachdem Sie den Rest der Matrix in eine 24-Well-Platte eingesehen haben, legen Sie die Platte 10 Minuten lang in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und überlagern Sie sie dann mit 800 Mikrolitern des Basiswachstumsmediums mit Wachstumsfaktoren entsprechend dem Manuskript.
Für Mikroinjektions-Assays mit rekombinanter menschlicher IL-22-Vorstimulation fügen Sie den Kulturmedien 18 Stunden vor Injektionen eine rekombinante menschliche IL-22 zu einer Endkonzentration von 100 Nanogramm pro Milliliter hinzu. Laden Sie die Mikroinjektionsschale mit Organoiden auf die Mikroskopstufe, entfernen Sie den Deckel und bringen Sie die Organoide in den Fokus, bereit für den Beginn der Injektion. Schalten Sie den Injektor und die Armsteuerungsstationen ein.
Stellen Sie sicher, dass der Injektor auf einen Druck von 600 Kilopascal und eine Injektionszeit von 0,5 Sekunden eingestellt ist. Wenn er nicht bereits von der Mikroskopstufe entfernt ist, drehen Sie den Injektionsarm, um sicherzustellen, dass er es ist, und entfernen Sie seinen Griffkopf. Die Bohrspitze mit 10 Mikrolitern des Inokulums beladen und die Bohrspitze an ihrem stumpfen Ende sanft greifen.
Legen Sie die Bohrspitze in den Griffkopf und befestigen Sie sie wieder am Mikroinjektionsarm. Bewegen Sie den Arm vorsichtig in eine Position, wo sich die Nadel ein bis zwei Zentimeter über der Mikroinjektionsschale befindet. Verwenden Sie die Armsteuerung, um die Nadelspitze in der Mitte der Schale zu positionieren, und senken Sie sie, bis sie sich gerade über der Oberfläche des Mediums befindet.
Programmieren Sie die Armkontrollstation, um die Nadel nach allen Injektionen an diesen Punkt zurückzubekommen. Konzentrieren Sie das Mikroskop auf die Organoide und wählen Sie das zu injizierende Ziel aus. Positionieren Sie die Nadel knapp darüber und das Recht des zu injizierenden Organoids, und bewegen Sie die Nadel nach unten und seitlich in das Organoidlumen.
Drücken Sie die Injektionstaste auf den Mikroinjektor, um das phenolgefärbte Bakteriengemisch aus der Nadel hervortreten zu lassen. Und jedes Organoid dreimal injizieren. Wenn alle erforderlichen Organoide injiziert werden, entfernen Sie die Mikroinjektionsplatte von der Bühne, ersetzen Sie den Deckel und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für 90 Minuten.
Nach der Inkubation die Wachstumsmedien ansaugen und durch drei Milliliter Zellhebelösung ersetzen. Dann bei vier Grad Celsius für 45 Minuten inkubieren. Als nächstes bewegen Sie die Organoide und die Zellhebelösung vorsichtig in ein 15-Milliliter-Konustube mit fünf Milliliter DPBS.
Zentrifuge bei 370-mal-G für drei Minuten. Entfernen Sie den Überstand, und fügen Sie einen Milliliter der Basis Wachstumsmedien enthält 0,1 Milligramm pro Milliliter Gentamicin. Als nächstes, mit einem P1000, Pipette auf und ab etwa 50 Mal, um die Organoide aufzubrechen.
Fügen Sie vier Milliliter mehr Medien hinzu und brüten Sie bei 37 Grad Celsius für eine Stunde, um extrazelluläre Bakterien abzutöten. Als nächstes zentrifugieren Sie die Organoide bei 370-mal-G für drei Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und lassen Sie so wenig wie möglich.
Die Organoide einmal mit DPBS waschen und wieder zentrifugieren. Fügen Sie 500 Mikroliter des Lysepuffers und Pipette etwa 50 Mal nach oben und unten hinzu, um die menschlichen Darmorganoide manuell zu dissoziieren. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für fünf Minuten, verdünnen Sie die resultierende Lösung in DPBS verzehnfacht.
Pipette drei 20-Mikron Tröpfchen der ordentlichen und verdünnten Lösungen auf vorgewärmte LB Agarplatten. Schließlich bei 37 Grad Celsius über Nacht inkubieren und mit der Koloniezählung fortfahren. Die menschlichen Darmorganoide wurden mit der phenolroten bakteriellen Lösung mikroinjiziert.
Die Beibehaltung dieser roten Farbe durch die Organoide verhindert doppelte Injektionen. Die Vorbehandlung der menschlichen Darmorganoide, die aus der COF-2-Zelllinie mit rekombinanter humaner IL-22 abgeleitet wurden, schränkt die Invasion von S.typhimurium SL1344 in Darmepithelzellen ein. Infizierte Organoide wurden zur Immunfärbung oder Transmissionselektronenmikroskopie verarbeitet, um die Visualisierung von IEC-Bakterienwechselwirkungen zu erleichtern.
RNA kann aus den injizierten Organoiden extrahiert werden, um die transkriptomische Reaktion auf Infektionen zu untersuchen. Fluoreszenz und Elektronenmikroskopie können auch verwendet werden, um Wirtspathogen-Wechselwirkungen genauer zu beobachten. Das Wichtigste, was Sie sich merken sollten, ist sicherzustellen, dass Sie genug Übung auf dem Mikroinjektor haben, um Ihre Injektionen schnell und effizient für konsistente Ergebnisse abschließen zu können.
Mikro-Injektionsbohrspitzen haben einen feinen, scharfen Punkt, und beim Be- und Entladen sollten Sie sie aus dem Mikroinjektor entladen. Diese Technik ermöglicht es, epitheliale Zellpathogen-Wechselwirkungen in bisher unerreichbaren Details zu untersuchen. Dieses Infektionsmodell wird besonders für diejenigen von Nutzen sein, die humanspezifische Krankheitserreger untersuchen.
