Ce protocole démontre l’utilité du système organoïde intestinal dérivé des cellules souches pour modéliser l’invasion épithéliale par des agents pathogènes entériques, et la modification de ce processus à l’aide de cytokines. La micro-injection permet à l’agent pathogène d’intérêt d’être livré directement dans la cavité luménale de l’organoïde, reproduisant plus étroitement le processus d’infection in vivo. Cette méthode pourrait être appliquée à l’étude de différents pathogènes en entéroïques ou cytokines alternatives d’intérêt.
Je suggère de terminer un essai de la procédure avec du phénol rouge seulement afin de maîtriser la technique de micro-injection avant d’utiliser des agents pathogènes. Le deuxième jour, commencer la différenciation en changeant les médias à 10 millilitres de milieu de culture des cellules souches, complétée par des facteurs de croissance. Le sixième jour, changer les médias à 10 millilitres de RPMI-B27 médias, complétée par six micromolaires CHIR99021, plus trois micromolaires d’acide rétinoïque pour commencer à modeler l’endoderm postérieur à l’arrière-pensée.
Le jour de différenciation 10, intégrer l’arrière-corps dans la matrice membranaire du sous-sol. Tout d’abord, retirez le média de la plaque arrière et lavez l’assiette avec du DPPS sans magnésium de calcium une fois. Ajouter cinq millilitres de solution de collagène à la plaque et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Ensuite, inactivez la collagène en ajoutant cinq millilitres du média de croissance de base organoïde à la plaque. Les cellules de l’arrière-corps devraient flotter à ce stade. Recueillir la suspension de l’arrière-gorge dans un tube conique de 15 millilitres.
Puis centrifugeuse à 240 fois-G pendant une minute. Après centrifugation, pipette hors du supernatant, ajouter 10 millilitres du corps de croissance de base organoïde, briser l’arrière-gorge en petits morceaux en pipetting doucement, et centrifugeuse à nouveau à 95 fois-G pendant une minute. Lavez les cellules dans le média de croissance de base organoïde deux fois.
Resuspendez les cellules en 300 à 500 microlitres du milieu de croissance de base, et ajoutez environ 100 microlitres de cette solution à 1,5 millilitres de la matrice membranaire du sous-sol. Installez une plaque de 24 puits sur un chauffe-plaques à 37 degrés Celsius. et repérer 60 microlitres du mélange de matrice de cellules postérieures dans un puits de la plaque de 24 puits.
Laissez-le régler brièvement et vérifiez la densité au microscope. Après avoir aperçu le reste de la matrice dans la plaque de 24 puits, incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ajoutez ensuite 800 microlitres du média de croissance de base contenant des facteurs de croissance à chaque puits de la plaque de 24 puits.
Pour passer les organoïdes, retirez d’abord le média d’eux, et remplacez-le par 500 microlitres par puits de la solution de levage cellulaire. Incuber à quatre degrés Celsius pendant 40 à 50 minutes, à quel point les organoïdes devraient flotter dans la solution. Pipette doucement les organoïdes et la solution de levage cellulaire en tubes coniques de 15 millilitres, en essayant de ne pas briser les organoïdes.
Après avoir permis aux organoïdes de se contenter de trois à cinq minutes, retirer le supernatant et les cellules individuelles. Resuspendez les organoïdes en cinq millilitres du milieu de croissance de base et pipettez-les doucement pour les laver. Centrifugeuse à 95 fois-G pendant deux minutes.
Ensuite, installez la plaque de 24 puits sur un chauffe-plaques à 37 degrés Celsius dans le capot, et retirez le supernatant de la pastille organoïde. Puis, à l’aide d’une pipette P1000, résuspendez les organoïdes en 300 à 500 microlitres du média de croissance de base pour décomposer les organoïdes en petits morceaux. Placez environ 100 microlitres des organoïdes dans 1,5 millilitres de la matrice membranaire du sous-sol et pipette brièvement pour mélanger.
Placez 60 microlitres de la matrice membranaire du sous-sol dans un puits de la plaque de 24 puits. Après l’avoir laissé se solidifier pendant 30 secondes, vérifiez la densité au microscope. Après avoir aperçu le reste de la matrice dans une plaque de 24 puits, placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis superposez-la avec 800 microlitres du milieu de croissance de base avec des facteurs de croissance selon le manuscrit.
Pour les analyses de micro-injection avec pré-stimulation humaine recombinante IL-22, ajoutez l’IL-22 humain recombinant au média de culture à une concentration finale de 100 nanogrammes par millilitre 18 heures avant les injections. Chargez le plat de micro-injection contenant des organoïdes sur le stade du microscope, retirez le couvercle et concentrez les organoïdes, prêts pour que l’injection commence. Allumez l’injecteur et les postes de contrôle des bras.
Assurez-vous que l’injecteur est réglé à une pression de 600 kilopascals et un temps d’injection de 0,5 seconde. S’il n’est pas déjà retiré du stade du microscope, faites pivoter le bras d’injection pour s’assurer qu’il l’est et retirez sa tête d’adhérence. Chargez la pointe de perceuse avec 10 microlitres de l’inoculum, en agrippant doucement la pointe de la perceuse à son extrémité émoussée.
Placez la pointe de la perceuse dans la tête d’adhérence et attachez-la au bras de micro-injection. Déplacez doucement le bras dans une position où l’aiguille est située d’un à deux centimètres au-dessus du plat de micro-injection. Utilisez le contrôle du bras pour positionner la pointe de l’aiguille au centre du plat et abaissez-la jusqu’à ce qu’elle soit juste au-dessus de la surface du média.
Programmez le poste de contrôle des bras pour retourner l’aiguille à ce point après toutes les injections. Concentrez le microscope sur les organoïdes et sélectionnez la cible à injecter. Placez l’aiguille juste au-dessus et le droit de l’organoïde à injecter, et déplacez l’aiguille vers le bas et latéralement dans le lumen organoïde.
Appuyez sur le bouton d’injection sur le micro-injecteur pour laisser le mélange de bactéries tachées de phénol émerger de l’aiguille. Et injecter chaque organoïde trois fois. Lorsque tous les organoïdes nécessaires sont injectés, retirez la plaque de micro-injection du stade, remplacez le couvercle et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes.
Après l’incubation, aspirer le média de croissance et le remplacer par trois millilitres de solution de levage cellulaire. Puis, incuber à quatre degrés Celsius pendant 45 minutes. Ensuite, déplacez doucement les organoïdes et la solution de levage cellulaire vers un tube conique de 15 millilitres contenant cinq millilitres de DPBS.
Centrifugeuse à 370 fois-G pendant trois minutes. Retirez le supernatant et ajoutez un millilitre du média de croissance de base contenant 0,1 milligramme par millilitr gentamicine. Ensuite, avec un P1000, pipette de haut en bas environ 50 fois pour briser les organoïdes.
Ajouter quatre millilitres de plus de médias, et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure pour tuer les bactéries extracellulaires. Ensuite, centrifuger les organoïdes à 370 fois-G pendant trois minutes. Aspirer le surnatant, en laissant aussi peu que possible.
Lavez les organoïdes avec DPBS une fois et centrifugez à nouveau. Ajouter 500 microlitres du tampon de lyse, et pipette de haut en bas environ 50 fois pour dissocier manuellement les organoïdes intestinaux humains. Après avoir cousu à température ambiante pendant cinq minutes, diluer en série la solution qui en résulte dix fois dans DPBS.
Pipette trois gouttelettes de 20 microns des solutions soignées et diluées sur des plaques d’agar LB préchauffées. Enfin, incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit et procéder au comptage des colonies. Les organoïdes intestinaux humains ont été micro-injectés avec la solution bactérienne rouge phénol.
La rétention de cette couleur rouge par les organoïdes empêche les injections en double. Le pré-traitement des organoïdes intestinaux humains dérivés de la lignée cellulaire COF-2 avec l’IL-22 humain recombinant limite l’invasion de S.typhimurium SL1344 dans les cellules épithéliales intestinales. Des organoïdes infectés ont été traités pour l’immuno-coloration, ou microscopie électronique de transmission, afin de faciliter la visualisation des interactions bactériennes d’IEC d’hôte.
L’ARN peut être extrait des organoïdes injectés pour examiner la réponse transcriptomique à l’infection. La fluorescence et la microscopie électronique peuvent également être utilisées pour observer plus en détail les interactions avec les pathogènes de l’hôte. La chose la plus importante à retenir est de s’assurer que vous avez eu assez de pratique sur le micro-injecteur pour être en mesure de compléter vos injections rapidement et efficacement pour des résultats cohérents.
Les pointes de forage à micro-injection ont un point fin et pointu, et il faut prendre soin de les charger et de les décharger du micro-injecteur. Cette technique permet d’étudier les interactions épithéliales des pathogènes cellulaires dans des détails auparavant impossibles à obtenir. Ce modèle d’infection sera d’une utilité particulière pour ceux qui étudient des agents pathogènes spécifiques à l’homme.
