Bu protokol, enterik patojenler tarafından epitel invazyonunun modellenmesi ve sitokinler kullanılarak bu sürecin modifikasyonu için kök hücre kaynaklı intestinal organoid sistemin yararını göstermektedir. Mikro enjeksiyon, ilgi patojeninin doğrudan organoidin lümenal boşluğuna iletilmesini sağlar ve in vivo enfeksiyon sürecini daha yakından çoğaltır. Bu yöntem farklı enterik patojenlerin veya alternatif sitokinlerin incelenmesinde uygulanabilir.
Ben sadece patojenler kullanmadan önce mikro enjeksiyon tekniği ana için fenol kırmızı ile prosedürün bir deneme çalışmasını tamamlamanızı öneririz. İkinci gün, büyüme faktörleri ile desteklenen kök hücre kültürü ortamının 10 mililitre medya değiştirerek farklılaşma başlar. Altıncı gün, RPMI-B27 medya 10 mililitre için medya değiştirin, altı mikromolar CHIR99021 ile desteklenen, artı üç mikromolar retinoik asit hindgut posterior endoderm desenleme başlamak için.
Farklılaşma 10. İlk olarak, hindgut plaka medya çıkarın ve kalsiyum magnezyum içermeyen DPPS ile bir kez plaka yıkayın. Plakaya beş mililitre kollajenaz çözeltisi ekleyin ve 5 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, plaka organoid baz büyüme ortamı beş mililitre ekleyerek kollajenaz inaktive. Hindgut hücreleri bu noktada yüzüyor olmalı. Hindgut süspansiyonu 15 mililitrelik konik bir tüpte toplayın.
Sonra bir dakika lığına 240-g'de santrifüj. Santrifüjden sonra, supernatant kapalı pipet, organoid baz büyüme ortamı 10 mililitre ekleyin, yavaşça pipetleme tarafından küçük parçalara hindgut kırmak, ve bir dakika için 95-kez-G tekrar santrifüj. Organoid baz büyüme ortamındaki hücreleri iki kez yıkayın.
Baz büyüme ortamının 300 ila 500 mikrolitredeki hücreleri yeniden askıya alın ve bu çözeltinin yaklaşık 100 mikrolitresini 1,5 milimetrelik baz membran matrisine ekleyin. 37 santigrat derecede bir plaka ısıtıcı üzerinde 24 kuyulu bir plaka ayarlayın. ve hindgut hücre matris karışımının 60 mikrolitresini 24 kuyuluk tan birine yerleştirin.
Kısa bir süre ayarlamak ve bir mikroskop altında yoğunluğunu kontrol edin. Matrisin geri kalanını 24 kuyulu plakaya yerleştirdikten sonra, plakayı 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra 24 kuyulu plakanın her kuyuya büyüme faktörleri içeren 800 mikrolitre temel büyüme ortamı ekleyin.
Organoidleri geçişiçin, önce medyayı onlardan çıkarın ve hücre kaldırma çözeltisinin kuyubaşına 500 mikrolitre ile değiştirin. 40-50 dakika boyunca 4 santigrat derecede kuluçka, bu noktada organoidler çözelti içinde yüzen olmalıdır. Organoidleri ve hücre kaldırma solüsyonunu 15 mililitrelik konik tüplere yavaşça pipetleyerek organoidleri parçalamamaya çalış.
Organoidler üç ila beş dakika yerleşmek için izin verildikten sonra, supernatant ve tek hücreleri çıkarın. Baz büyüme ortamının beş mililitresinde organoidleri yeniden askıya alın ve yıkamak için pipetleyin. Santrifüj 95-kez-G'de iki dakika.
Sonra, kaputiçinde 37 santigrat derece bir plaka ısıtıcı üzerinde 24-iyi plaka kurmak ve organoid pelet supernatant kaldırın. Daha sonra, bir P1000 pipet kullanarak, organoidleri daha küçük parçalara ayırmak için baz büyüme ortamının 300 ila 500 mikrolitresinde organoidleri yeniden askıya alın. 1.5 mililitre içine organoidlerin yaklaşık 100 mikrolitre yerleştirin 1.5 bazal membran matris ve pipet kısaca karıştırmak için.
24 kuyulu plakanın bir kuyusunda 60 bazal bazal matrisi tespit edin. 30 saniye katılaşmak için bıraktıktan sonra, mikroskop altında yoğunluğunu kontrol edin. Matrisin geri kalanını 24 kuyuluk bir plakaya yerleştirdikten sonra, tabağı 37 derecede 10 dakika kuvöze yerleştirin ve sonra el yazmasına göre büyüme faktörleri ile baz büyüme ortamının 800 mikrolitresini kaplayın.
Rekombinant insan IL-22 ön stimülasyonu ile mikro enjeksiyon tahlilleri için, enjeksiyonlardan 18 saat önce mililitre başına 100 nanogramlık son konsantrasyona kültür ortamına rekombinant insan IL-22 ekleyin. Organoidiçeren mikro enjeksiyon kabını mikroskop aşamasına yükleyin, kapağı çıkarın ve organoidleri enjeksiyonun başlamasına hazır olarak odak lara getirin. Enjektörü ve kol kontrol istasyonlarını açın.
Enjektörün 600 kilopascal ve enjeksiyon süresi 0,5 saniye lik bir basınca ayarlandığından emin olun. Mikroskop aşamasından geri adım atılmazsa, enjeksiyon kolunu olduğundan emin olmak için döndürün ve kavrama kafasını çıkarın. Matkap ucunu 10 mikrolitre inokülle yükleyin ve matkap ucunu künt ucunda hafifçe tutarak yükleyin.
Matkap ucunu kavrama kafasına yerleştirin ve mikro enjeksiyon koluna yeniden takın. Kolu, iğnenin mikro enjeksiyon kabının 1-2 santimetre üzerinde yer aldığı bir konuma yavaşça hareket ettirin. İğne ucunu yemeğin ortasına yerle bir etmek için kol kontrolünü kullanın ve ortam yüzeyinin hemen üzerinde olana kadar düşürün.
Tüm enjeksiyonlardan sonra iğneyi bu noktaya geri döndürmek için kol kontrol istasyonunu programlayın. Mikroskobu organoidlere odakla ve enjekte etmek için hedefi seç. İğneyi hemen yukarıya ve organoidin sağ ını enjekte etmek üzere yerleştirin ve iğneyi aşağı ve yanal olarak organoid lümenin içine taşıyın.
Fenol lekeli bakteri karışımının iğneden çıkması için mikro enjektörün üzerindeki enjektör düğmesine basın. Ve her organoidi üç kez enjekte edin. Gerekli tüm organoidler enjekte edildiğinde, mikro enjeksiyon plakasını sahneden çıkarın, kapağı değiştirin ve 90 dakika boyunca 37 derecede plakayı kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, büyüme ortamını aspire edin ve üç mililitre hücre kaldırma çözeltisi ile değiştirin. Sonra, 45 dakika boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya yat. Daha sonra, organoidleri ve hücre kaldırma solüsyonu'nu beş mililitre DPBS içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe nazikçe taşıyın.
3 dakika 370 kere-G'de santrifüj. Supernatant çıkarın ve mililitre gentamisin başına 0,1 miligram içeren baz büyüme ortamı bir mililitre ekleyin. Sonra, bir P1000 ile, pipet yukarı ve aşağı yaklaşık 50 kez organoidler kırmak için.
Dört mililitre daha fazla ortam ekleyin ve hücre dışı bakterileri öldürmek için bir saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yat. Sonra, 370-g-G üç dakika için organoidler santrifüj. Supernatant aspire, mümkün olduğunca az bırakarak.
Organoidleri DPBS ile bir kez yıkayın ve tekrar santrifüj edin. 500 mikrolitre likit tampon ekleyin ve pipet yaklaşık 50 kez yukarı ve aşağı insan bağırsak organoidleri el ile ayrıştırmak için. Beş dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yattıktan sonra, dpbs'de elde edilen çözeltiyi on kat daha fazla seri olarak seyreltin.
Önceden ısıtılmış LB agar plakaları üzerine düzgün ve seyreltilmiş çözeltilerin pipet üç 20 mikron damlacıkları. Son olarak, bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatve koloni saymaya devam edin. İnsan bağırsak organoidleri fenol kırmızıbakteriyel çözelti ile mikro enjekte edildi.
Bu kırmızı rengin organoidler tarafından tutulması yinelenen enjeksiyonları önler. Rekombinant insan IL-22 ile COF-2 hücre hattından elde edilen insan bağırsak organoidlerinin ön tedavisi s.typhimurium SL1344 bağırsak epitel hücrelerine invazyonu kısıtlar. Enfekte organoidler, konak IEC bakteri etkileşimlerinin görselleştirilmesini kolaylaştırmak amacıyla immüno-boyama veya iletim elektron mikroskobu için işlenmiştir.
RNA enfeksiyona transkripsiyonel yanıt bakmak için enjekte organoidler elde edilebilir. Floresan ve elektron mikroskobu da konak patojen etkileşimlerini daha ayrıntılı olarak gözlemlemek için kullanılabilir. Hatırlanması gereken en önemli şey, tutarlı sonuçlar için enjeksiyonlarınızı hızlı ve verimli bir şekilde tamamlayabilmek için mikro enjektör üzerinde yeterli uygulama yaptığınızdan emin olmaktır.
Mikro enjeksiyon matkap uçları ince, keskin bir noktaya sahiptir ve mikro enjektörden yüklenirken ve boşaltırken dikkatli olunmalıdır. Bu teknik epitel hücre patojen etkileşimlerinin daha önce elde edilemeyen ayrıntılı olarak incelenmesini sağlar. Bu enfeksiyon modeli insana özgü patojenleri inceleyenler için özel olarak kullanılacaktır.
