利用人类诱导的多能干细胞衍生的肠道有机体研究和改性上皮细胞对沙门氏菌和其他病原体的保护

该协议演示了干细胞衍生肠道器官系统对肠道病原体上皮入侵建模的实用性，以及利用细胞因子修改这一过程。微注射允许感兴趣的病原体直接传递到器官的流明腔，更密切地复制体内的感染过程。该方法可应用于研究不同的肠病原体或感兴趣的替代细胞因子。

我建议在使用病原体之前，先用酚红色完成手术的试运行，以便掌握微注射技术。第二天，通过改变培养媒体对10毫升干细胞培养培养媒介的分化开始，辅以生长因子。第六天，将介质更改为 10 毫升的 RPMI-B27 介质，辅以 6 微摩尔 CHIR99021，外加三微摩尔视网膜酸，开始将后侧内皮纹型图案化到后侧。

在分化第10天，将后体嵌入地下室膜基质中。首先，从后盘上取下介质，用无钙镁的D盘洗一次。在板中加入5毫升胶原酶溶液，在37摄氏度下孵育5分钟。

接下来，通过向板中加入五毫升的器官基生长介质来灭活胶原蛋白。此时，后向单元格应浮动。在 15 毫升锥形管中收集后侧悬浮液。

然后在240次G下离心1分钟。离心后，移液器关闭上流液，加入10毫升的器官基生长介质，通过轻轻移液将后侧分解成更小的碎片，并在95倍-G下再次离心一分钟。两次清洗器官基生长介质中的细胞。

将细胞重新吸收在基生长介质的300至500微升中，并将该溶液的约100微升添加到基膜基质的1.5毫升中。在 37 摄氏度的板加热器上设置一个 24 井板。将 60 微升的后糖基质混合物分入 24 井板的一个井中。

允许它短暂设置，并在显微镜下检查密度。将基质的其余部分放入24井板后，在37摄氏度下孵育该板10分钟。然后，在24井板的每个井中加入800微升的基生长介质，其中含有生长因子。

要通过器官，首先从细胞提升溶液中去除介质，然后用每井500微升代替。在4摄氏度下孵育40至50分钟，此时器官应漂浮在溶液中。轻轻地将器官和细胞提升溶液移液到15毫升的圆锥管中，尽量不分解器官。

在允许器官沉淀三到五分钟后，取出上清液和单细胞。将有机体在基生长介质的五毫升中重新暂停，并轻轻移液洗涤。在 95 次 G 下离心两分钟。

接下来，在发动机罩内37摄氏度的板加热器上设置24井板，并从有机颗粒中去除上流液。然后，使用P1000移液器，在基生长介质的300至500微升中重新暂停器官，将器官分解成更小的块状体。将大约100微升的器官放入1.5毫升的地下室膜基质和移液器短暂混合。

将 60 微升的地下室膜基质放入 24 孔板的一个孔中。离开凝固30秒后，在显微镜下检查密度。在将基质的其余部分放入24井板后，将该板在37摄氏度的培养箱中放置10分钟，然后根据手稿将基生长介质的800微升与生长因子叠加。

对于重组人类IL-22预刺激的微注射测定，在注射前18小时将重组的人类IL-22加入培养培养剂，最终浓度为每毫升100毫微克。将含有有机体的微注射盘加载到显微镜阶段，取下盖子，将器官聚焦到焦点，准备开始注射。打开喷油器和臂控制站。

确保喷油器设置为 600 千帕的压力和 0.5 秒的喷射时间。如果尚未从显微镜阶段后退，则旋转注射臂以确保其为，并拆下其夹头。用 10 微升的 inolum 加载钻头，在钝端轻轻抓住钻头。

将钻头放入夹头，然后重新连接到微喷射臂上。轻轻地将手臂移动到针头位于微注射盘上方一到两厘米的位置。使用手臂控制将针尖放在菜盘中央，然后降低，直到它刚刚在介质表面。

编程臂控制站返回针到这一点后，所有注射。将显微镜聚焦在器官上，然后选择要注射的目标。将针头位于正上方和要注射的器官的右侧，向下移动针头并横向移动到器官流明中。

按下微注射器上的注射按钮，让苯酚染色细菌混合物从针头中浮现出来。并注射每个器官三次。当注射所有必需的有机体时，从舞台上取出微注射板，更换盖子，并在37摄氏度下孵育板90分钟。

孵育后，吸生长培养培养，代之以三毫升的细胞提升溶液。然后，在4摄氏度下孵育45分钟。接下来，轻轻地将器官和细胞提升溶液移动到含有5毫升DPBS的15毫升锥形管中。

在370次-G下离心3分钟。去除上一升液，并加入每毫升根霉素含有0.1毫克的基本生长介质1毫升。接下来，用P1000，移液器上下约50次，以分解器官。

多加四毫升的介质，在摄氏37度下孵育一小时，杀死细胞外细菌。接下来，在370次-G下将器官离心3分钟。吸上一道，尽可能少地离开。

用 DPBS 清洗器官一次，然后再次离心。加入500微升的解液缓冲液，并上下移液器约50次，手动分离人类肠道器官。在室温下孵育五分钟后，在 DPBS 中连续稀释所得溶液十倍。

将三个 20 微米液滴的整洁和稀释溶液滴到预热的 LB 加糖板上。最后，在37摄氏度过夜孵育，并继续对菌群进行计数。人体肠道器官微注射酚红色细菌溶液。

器官保留这种红色可防止重复注射。从COF-2细胞系中提取的人类肠道器官与重组人类IL-22的预处理限制了S.typhimuriumSL1344进入肠道上皮细胞。受感染的器官被处理为免疫染色，或传输电子显微镜，以方便宿主 IEC 细菌相互作用的可视化。

RNA可以从注射的器官中提取，以查看对感染的转录反应。荧光和电子显微镜也可用于更详细地观察宿主病原体相互作用。要记住的最重要的事情是确保您在微喷油器上有足够的练习，以便能够快速高效地完成注射，获得一致的结果。

微喷射钻头具有细、锐点，从微喷油器上装载和卸载时应小心。这种技术允许在以前无法获得的细节中研究上皮细胞病原体相互作用。这种感染模型对于研究人类特异性病原体的人尤其具有用途。