Questo protocollo dimostra l'utilità del sistema organoide intestinale derivato dalle cellule staminali per modellare l'invasione epiteliale da parte di agenti patogeni enterici e la modifica di questo processo usando citochine. La micro-iniezione consente di consegnare l'agente patogeno di interesse direttamente nella cavità lumenale dell'organoide, replicando più da vicino il processo di infezione in vivo. Questo metodo potrebbe essere applicato allo studio di diversi patogeni enterici o citochine alternative di interesse.
Suggerirei di completare una prova della procedura con il rosso fenolo solo per padroneggiare la tecnica di microiniezione prima di utilizzare agenti patogeni. Il secondo giorno, inizia la differenziazione cambiando il mezzo in 10 millilitri di mezzo di coltura delle cellule staminali, integrato con fattori di crescita. Il sesto giorno, cambiare il supporto in 10 millilitri di supporti RPMI-B27, integrati con sei micromolari CHIR99021, più tre acido retinoico micromolare per iniziare a modellare l'endoderma posteriore al broncio posteriore.
Il giorno di differenziazione 10, incorporare il broncio posteriore nella matrice della membrana basale. In primo luogo, rimuovere il supporto dalla piastra posteriore e lavare la piastra con DPPS privo di magnesio di calcio una volta. Aggiungere cinque millilitri di soluzione di collagenasi al piatto e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Successivamente, inattivare la collagenasi aggiungendo cinque millilitri del supporto di crescita della base organoide alla piastra. Le cellule del broncio posteriore dovrebbero galleggiare a questo punto. Raccogliere la sospensione del broncio posteriore in un tubo conico da 15 millilitri.
Quindi centrifugare a 240 volte-G per un minuto. Dopo la centrifugazione, pipettare fuori dal supernatante, aggiungere 10 millilitri del mezzo di crescita della base organoide, rompere il broncio posteriore in pezzi più piccoli pipettando delicatamente e centrifugare di nuovo a 95 volte G per un minuto. Lavare le cellule nel supporto di crescita della base organoide due volte.
Rimospendare le cellule in 300-500 microlitri del mezzo di crescita di base e aggiungere circa 100 microlitri di questa soluzione a 1,5 millilitri della matrice di membrana basale. Impostare una piastra da 24 po 'su un riscaldatore a piastre a 37 gradi Celsius. e individuare 60 microlitri della miscela di matrice cellulare del germoglio posteriore in un pozzo della piastra a 24 pozzi.
Lasciare che si metta brevemente e controlli la densità al microscopio. Dopo aver avvistare il resto della matrice nella piastra di 24 po ', incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi aggiungere 800 microlitri del supporto di crescita di base contenente fattori di crescita ad ogni pozzo della piastra da 24 porri.
Per passare gli organoidi, rimuovere prima il supporto da essi e sostituirlo con 500 microlitri per pozzo della soluzione di sollevamento cellulare. Incubare a quattro gradi Celsius per 40-50 minuti, a quel punto gli organoidi dovrebbero galleggiare nella soluzione. Pipettare delicatamente gli organoidi e la soluzione di sollevamento cellulare in tubi conici da 15 millilitri, cercando di non rompere gli organoidi.
Dopo aver permesso agli organoidi di depositarsi per tre o cinque minuti, rimuovere il supernatante e le singole cellule. Rimorsi gli organoidi in cinque millilitri del mezzo di crescita di base e pipettarli delicatamente per lavare. Centrifuga a 95 volte-G per due minuti.
Successivamente, impostare la piastra di 24 po 'su un riscaldatore a piastre a 37 gradi Celsius all'interno del cofano e rimuovere il supernatante dal pellet organoide. Quindi, usando una pipetta P1000, ha rimescolato gli organoidi in 300-500 microlitri del supporto di crescita di base per rompere gli organoidi in pezzi più piccoli. Posizionare circa 100 microlitri degli organoidi in 1,5 millilitri della matrice della membrana basale e pipettare brevemente da mescolare.
Individuare 60 microlitri della matrice della membrana basale in un unico pozzo della piastra a 24 pozzi. Dopo aver lasciato che si solidificasse per 30 secondi, controllare la densità al microscopio. Dopo aver individuato il resto della matrice in una piastra di 24 porri, posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 10 minuti, quindi sovrapporla con 800 microlitri del mezzo di crescita di base con fattori di crescita secondo il manoscritto.
Per i test di micro-iniezione con prestimolazione UMANA IL-22 ricombinante, aggiungere l'IL-22 umano ricombinante al mezzo di coltura a una concentrazione finale di 100 nanogrammi per millilitro 18 ore prima delle iniezioni. Caricare la parabola di micro-iniezione contenente organoidi sullo stadio del microscopio, rimuovere il coperchio e mettere a fuoco gli organoidi, pronti per l'inizio dell'iniezione. Accendere l'iniettore e le stazioni di controllo del braccio.
Assicurarsi che l'iniettore sia impostato su una pressione di 600 kilopascal e un tempo di iniezione di 0,5 secondi. Se non è già supportato dallo stadio del microscopio, ruotare il braccio di iniezione per assicurarsi che lo sia e rimuovere la testa di presa. Caricare la punta del trapano con 10 microlitri dell'inoculo, afferrando delicatamente la punta del trapano alla sua estremità smussata.
Posizionare la punta del trapano nella testa di presa e riattaccarla al braccio di micro-iniezione. Spostare delicatamente il braccio in una posizione in cui l'ago si trova da uno a due centimetri sopra il piatto di micro-iniezione. Utilizzare il controllo del braccio per posizionare la punta dell'ago al centro del piatto e abbassarla fino a quando non è appena sopra la superficie del supporto.
Programmare la stazione di controllo del braccio per riportare l'ago a questo punto dopo tutte le iniezioni. Mettere a fuoco il microscopio sugli organoidi e selezionare il bersaglio da iniettare. Posizionare l'ago appena sopra e la destra dell'organoide da iniettare e spostare l'ago verso il basso e lateralmente nel lume organoide.
Premere il pulsante di iniezione sul micro-iniettore per far emergere dall'ago la miscela di batteri macchiati di fenolo. E iniettare ogni organoide tre volte. Quando vengono iniettati tutti gli organoidi richiesti, rimuovere la piastra di micro-iniezione dallo stadio, sostituire il coperchio e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 90 minuti.
Dopo l'incubazione, aspirare il supporto di crescita e sostituirlo con tre millilitri di soluzione di sollevamento cellulare. Quindi, incubare a quattro gradi Celsius per 45 minuti. Successivamente, spostare delicatamente gli organoidi e la soluzione di sollevamento cellulare in un tubo conico da 15 millilitri contenente cinque millilitri di DPBS.
Centrifuga a 370 volte-G per tre minuti. Rimuovere il supernatante e aggiungere un millilitro del mezzo di crescita di base contenente 0,1 milligrammi per gentamicina millilitro. Successivamente, con un P1000, pipetta su e giù circa 50 volte per rompere gli organoidi.
Aggiungere quattro millilitri più mezzi e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora per uccidere i batteri extracellulari. Quindi, centrifuga gli organoidi a 370 volte G per tre minuti. Aspirare il supernatante, lasciando il meno possibile.
Lavare gli organoidi con DPBS una volta e centrifugare di nuovo. Aggiungere 500 microlitri del tampone dilisi e pipettare su e giù circa 50 volte per dissociare manualmente gli organoidi intestinali umani. Dopo aver incubato a temperatura ambiente per cinque minuti, diluire serialmente la soluzione risultante dieci volte in DPBS.
Pipettare tre goccioline da 20 micron delle soluzioni pulite e diluite su piastre di agar LB prerifavorate. Infine, incubare a 37 gradi Celsius durante la notte e procedere con il conteggio delle colonie. Gli organoidi intestinali umani sono stati microiniettati con la soluzione batterica rosso fenolo.
La ritenzione di questo colore rosso da parte degli organoidi impedisce iniezioni duplicate. Il pretrattamento degli organoidi intestinali umani derivati dalla linea cellulare COF-2 con IL-22 umano ricombinante limita l'invasione di S.typhimurium SL1344 nelle cellule epiteliali intestinali. Gli organoidi infetti sono stati elaborati per la colorazione immuno, o microscopia elettronica a trasmissione, al fine di facilitare la visualizzazione delle interazioni batteriche IEC ospiti.
L'RNA può essere estratto dagli organoidi iniettati per esaminare la risposta trascritomica all'infezione. La fluorescenza e la microscopia elettronica possono anche essere utilizzate per osservare le interazioni patogene ospiti in modo più dettagliato. La cosa più importante da ricordare è assicurarsi di aver avuto abbastanza pratica sul micro-iniettore per essere in grado di completare le iniezioni in modo rapido ed efficiente per risultati coerenti.
Le punte di perforazione a micro iniezione hanno un punto fine e affilato e si deve fare attenzione quando le si carica e le si scarica dal micro-iniettore. Questa tecnica consente di studiare le interazioni dell'agente patogeno delle cellule epiteliali in dettagli precedentemente introvabili. Questo modello di infezione sarà di particolare uso per coloro che studiano agenti patogeni specifici per l'uomo.
