Este protocolo demuestra la utilidad del sistema organoide intestinal derivado de células madre para modelar la invasión epitelial por patógenos entéricos, y la modificación de este proceso utilizando citoquinas. La microinyección permite que el patógeno de interés se entregue directamente en la cavidad lumenal del organoide, replicando más de cerca el proceso de infección in vivo. Este método podría aplicarse al estudio de diferentes patógenos entéricos o citoquinas alternativas de interés.
Yo sugeriría completar una ejecución de prueba del procedimiento con rojo fenol sólo con el fin de dominar la técnica de micro-inyección antes de usar patógenos. En el segundo día, comenzar la diferenciación cambiando los medios a 10 mililitros de medio de cultivo de células madre, complementado con factores de crecimiento. En el sexto día, cambie los medios a 10 mililitros de medios RPMI-B27, complementados con seis micromolares CHIR99021, más tres micromolares de ácido retinoico para comenzar a modelar el endodermo posterior a la placa posterior.
En el día de diferenciación 10, incruste la bandeja posterior en la matriz de membrana del sótano. En primer lugar, retire el medio de la placa posterior y lave la placa con DPPS sin magnesio de calcio una vez. Añadir cinco mililitros de solución de colagenasa a la placa e incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos.
A continuación, inactivar la colagenasa añadiendo cinco mililitros del medio de crecimiento de la base organoides a la placa. Las celdas posteriores deben estar flotando en este punto. Recoger la suspensión posterior en un tubo cónico de 15 mililitros.
Luego centrifugar a 240 veces-G durante un minuto. Después de la centrifugación, pipetear el sobrenadante, añadir 10 mililitros de los medios de crecimiento de la base organoides, dividir la columna posterior en trozos más pequeños por pipeteo suave, y centrifugar de nuevo a 95 veces-G durante un minuto. Lavar las células en el medio de crecimiento de la base organoides dos veces.
Resuspender las células en 300 a 500 microlitros del medio de crecimiento base, y añadir aproximadamente 100 microlitros de esta solución a 1,5 mililitros de la matriz de membrana del sótano. Coloca una placa de 24 pozos en un calentador de placas a 37 grados Celsius. y detectar 60 microlitros de la mezcla de matriz celular de la parte posterior en un pozo de la placa de 24 pozos.
Permita que se ajuste brevemente y compruebe la densidad bajo un microscopio. Después de detectar el resto de la matriz en la placa de 24 pozos, incubar la placa a 37 grados Celsius durante 10 minutos. A continuación, agregue 800 microlitros de los medios de crecimiento base que contienen factores de crecimiento a cada pozo de la placa de 24 pozos.
Para pasar organoides, primero retire el medio de ellos, y reemplácelo con 500 microlitros por pozo de la solución de elevación celular. Incubar a cuatro grados Centígrados durante 40 a 50 minutos, momento en el que los organoides deben estar flotando en la solución. Pipetear suavemente los organoides y la solución de elevación celular en tubos cónicos de 15 mililitros, tratando de no romper los organoides.
Después de permitir que los organoides se asienten durante tres a cinco minutos, retire el sobrenadante y las células individuales. Resuspender los organoides en cinco mililitros del medio de crecimiento base, y pipetearlos suavemente para lavar. Centrifugar a 95 veces-G durante dos minutos.
A continuación, coloca la placa de 24 pozos en un calentador de placas a 37 grados Celsius dentro de la capucha, y retira el sobrenadante del pellet organoide. Luego, usando una pipeta P1000, resuspendir los organoides en 300 a 500 microlitros de los medios de crecimiento base para dividir los organoides en trozos más pequeños. Coloque aproximadamente 100 microlitros de los organoides en 1,5 mililitros de la matriz de membrana del sótano y pipeta brevemente para mezclar.
Detectar 60 microlitros de la matriz de membrana del sótano en un pozo de la placa de 24 pozos. Después de dejarlo solidificar durante 30 segundos, compruebe la densidad bajo el microscopio. Después de detectar el resto de la matriz en una placa de 24 pozos, coloque la placa en una incubadora a 37 grados celsius durante 10 minutos, y luego superponga con 800 microlitros del medio de crecimiento base con factores de crecimiento según el manuscrito.
Para ensayos de microinyección con preestimulación IL-22 humana recombinante, añada IL-22 humano recombinante a los medios de cultivo a una concentración final de 100 nanogramos por mililitro 18 horas antes de las inyecciones. Cargue el plato de microinyección que contiene organoides en la etapa del microscopio, retire la tapa y ponga los organoides en el foco, listos para que comience la inyección. Encienda el inyector y las estaciones de control de brazos.
Asegúrese de que el inyector esté ajustado a una presión de 600 kilopascales y a un tiempo de inyección de 0,5 segundos. Si aún no está alejado de la etapa del microscopio, gire el brazo de inyección para asegurarse de que lo está y retire su cabezal de agarre. Cargue la punta del taladro con 10 microlitros del inóculo, agarrando suavemente la punta del taladro en su extremo romo.
Coloque la punta de la broca en la cabeza de agarre y vuelva a colocarla en el brazo de microinyección. Mueva suavemente el brazo en una posición en la que la aguja esté situada de uno a dos centímetros por encima de la placa de microinyección. Utilice el control del brazo para colocar la punta de la aguja en el centro de la placa y bajarla hasta que esté justo sobre la superficie del medio.
Programe la estación de control del brazo para devolver la aguja a este punto después de todas las inyecciones. Enfoque el microscopio en los organoides y seleccione el objetivo a inyectar. Coloque la aguja justo encima y a la derecha del organoide que se va a inyectar, y mueva la aguja hacia abajo y lateralmente hacia el lumen organoide.
Presione el botón de inyección en el microinyector para dejar que la mezcla de bacterias manchadas de fenol salga de la aguja. E inyectar cada organoide tres veces. Cuando se inyecten todos los organoides necesarios, retire la placa de microinyección de la etapa, reemplace la tapa e incuba la placa a 37 grados centígrados durante 90 minutos.
Después de la incubación, aspirar los medios de crecimiento y reemplazarlo con tres mililitros de solución de elevación celular. Luego, incubar a cuatro grados centígrados durante 45 minutos. A continuación, mueva suavemente los organoides y la solución de elevación celular a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de DPBS.
Centrifugar a 370 veces-G durante tres minutos. Retire el sobrenadante y agregue un mililitro del medio de crecimiento base que contiene 0,1 miligramos por mililitro de gentamicina. A continuación, con un P1000, pipeta hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 50 veces para romper los organoides.
Añadir cuatro mililitros más medios, e incubar a 37 grados Celsius durante una hora para matar las bacterias extracelulares. A continuación, centrifugar los organoides a 370 veces-G durante tres minutos. Aspirar el sobrenadante, dejando lo menos posible.
Lave los organoides con DPBS una vez y centrifugar de nuevo. Añadir 500 microlitros del tampón de la lelisis, y pipetear hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 50 veces para disociar manualmente los organoides intestinales humanos. Después de incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos, diluir en serie la solución resultante diez veces en DPBS.
Pipetear tres gotas de 20 micras de las soluciones limpias y diluidas en placas de agar LB precaleadas. Finalmente, incubar a 37 grados centígrados durante la noche y proceder con el recuento de colonias. Los organoides intestinales humanos fueron micro-inyectados con la solución bacteriana roja fenol.
La retención de este color rojo por los organoides previene las inyecciones duplicadas. El pretratamiento de los organoides intestinales humanos derivados de la línea celular COF-2 con IL-22 humano recombinante restringe la invasión de S.typhimurium SL1344 en células epiteliales intestinales. Los organoides infectados se procesaron para inmunomantelación, o microscopía electrónica de transmisión, con el fin de facilitar la visualización de las interacciones bacterianas del IEC del huésped.
El ARN se puede extraer de los organoides inyectados para examinar la respuesta transcriptómica a la infección. La fluorescencia y la microscopía electrónica también se pueden utilizar para observar las interacciones de los patógenos del huésped con más detalle. Lo más importante a recordar es asegurarse de que usted ha tenido suficiente práctica en el micro-inyector para ser capaz de completar sus inyecciones de forma rápida y eficiente para obtener resultados consistentes.
Las puntas de perforación de microinyección tienen un punto fino y afilado, y se debe tener cuidado al cargarlas y descargarlas del microinyector. Esta técnica permite estudiar las interacciones de patógenos de células epiteliales con detalles previamente inalcanzables. Este modelo de infección será de particular utilidad para aquellos que estudian patógenos específicos del ser humano.
