我々の方法は、細胞死の種類を調べ、活性酸素種の産生を調べるなど、ナノ毒性を研究するための簡単で繰り返しの方法を概説する。蛍光活性化細胞の並べ替えは、細胞のサブ人口と成長する異なる種類の細胞死を研究することを可能にする厳格な形式です。DHEプローブの研究方法により、活性酸素種を検出して定量化し、続いてフローサイトメトリー、微視的高含有イメージング、および結合ベースの蛍光分析を行うことができます。
まず、酸化亜鉛ナノ粒子を含むエペンドルフチューブを酸化亜鉛ナノ粒子ストック溶液に15分間ソニケーターに入れます。1ミリリットル当たり1ミリグラムの酸化亜鉛ナノ粒子ストックを用いて、様々な濃度で酸化亜鉛ナノ粒子を調製する。次いで、バイオセーフティキャビネットにおいて、ヒト肺線維芽細胞を3つの6ウェル培養プレートに播種し、1回10〜5番目の細胞を1回の濃度で及ぶ。
37°Cで細胞をインキュベートします。1日後、2ミリリットルの酸化亜鉛ナノ粒子で細胞を8時間、16時間、または24時間処理します。各時点で、細胞を15ミリリットルの遠心管に集め、遠心分離機を300回gで5分間回収する。
リン酸緩衝生理食塩水で細胞ペレットを2回洗浄し、1X結合バッファーで細胞を再中断します。次に、5マイクロリットルのFITCアネキシンV染色を5マイクロリットルのヨウ化プロピジウムDNA染色に加える。暗い温度で15分間、染色した細胞をインキュベートします。
フローサイトメトリーで細胞を選別する前に、サンプルを追加の400マイクロリットルの1X結合バッファーで上に上げてください。取得した中央値強度を使用して、棒グラフを集計します。ピペットを使用してバイアルに異なる濃度で1ミリリットルのナノ粒子を追加し、続いて9ミリリットルのフライフードを使用して、1ミリリットル当たり0.1ミリグラム、ミリリットル当たり0.25ミリグラム、または1ミリリットルの酸化亜鉛ナノ粒子あたり0.5ミリグラムの最終濃度を作ります。
ピペットを上下にして完全に混ぜます。酸化亜鉛ナノ粒子を含むフライ食品を、使用前に少なくとも2〜3時間冷却することを許可する。その後、二酸化炭素を含むバイアルで成体の雄と雌のハエを麻酔し、5日間、5匹のオスハエと5匹の雌のハエを各バイアルに導入します。
彼らが交尾し、食べ物の表面に卵を産むことを許可します。麻酔後、親のハエを取り除き、卵が4つの異なる発達段階で構成される室温でさらなる発達を受けることを可能にする。胚性、幼虫、子犬、および成人期。
72〜120時間後、産きたての卵は3番目後半のインスター幼虫に発達する。鉗子を使用して、分析のためにバイアルの壁から幼虫を収集します。解剖媒体またはPBSを含む解剖皿の井戸に、幼虫を溶液に入れる。
実体顕微鏡では、鉗子の先端を使って小さな穴を開け、幼虫のキューティクル層を開きます。慎重に腸を引き出します。シュナイダーのショウジョウバエ培地を含む1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに腸を入れる。
DHEプローブを1マイクロリットル加え、室温で暗闇の中で10分間インキュベートします。5分ごとにシュナイダーのミディアムを使用して腸を3回洗います。ガラススライドに腸を取り付け、DAPIを含むアンチフェード実装媒体の10マイクロリットルを供給します。
共焦点顕微鏡で画像をキャプチャします。蛍光を測定するには、蛍光顕微鏡または共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して取得した蛍光画像をImageJソフトウェアにインポートします。分析メニューをクリックし、測定の設定を選択します。
面積積分強度、平均グレー値などの出力メジャーを選択します。背景を設定するには蛍光のない領域を選択します。メジャーをクリックします。
データをスプレッドシートにエクスポートし、補正された全細胞蛍光を決定します。棒グラフを作成し、統計分析を実行します。本研究では、酸化亜鉛ナノ粒子処理細胞は、コントロール細胞R5よりも初期のR3または後期アポトーシスR6細胞の割合が高いことを示す。壊死細胞死はR4によって示された。ショウジョウバの幼虫から抽出された腸は、異なる発達起源の3つの離散ドメインに分けられた。
すなわち、前腸、中腸、後腸。DHE在庫は、かなり早く期限切れになる傾向があるので、使用しているストックソリューションに注意してください。あるいは、緑色の信号で細胞内ROSを検出するように設計された細胞ロシュなどの他のプローブを試すことができます。
我々のプロトコルは、細胞内ROS産生を研究するための一般的な概要を提供し、ナノ毒性研究のためのROSレベルの定量化を提供する。DMSOは、PBSよりもDHEに対して優れた溶媒であることが知られている。しかし、DMSOは有毒です。
したがって、私は、最大30分に学習するための全体のプロセスを制限するためにユーザーに助言したいと思います。DMSO が細胞死を引き起こす可能性があるため、偽陽性の結果を観察する可能性があるためです。.
