この方法は、ショウジョウバエの発症の複数段階における血液脳関門の形成および維持の遺伝的調節に関する重要な質問に答える助けとなる。この方法は、様々な生物における腸上皮のような他の障壁の透過性を調べるようにも適合させることができる。この技術の主な利点は、それが生きている組織における血液脳関門機能の評価を可能にすることです.
サンプル操作は難しく、多くのステップでは細部まで細心の注意を払う必要があるため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。胚コレクションのためにコーンミール寒天食品とボトルあたり20〜25人の男性を持つ最低50人の処女女性を配置し、コレクションを開始する前に1〜2日間これらのハエをインキュベートします。コレクションの前日には、一晩で摂氏25度の温かいリンゴジュース寒天プレート。
翌朝、麻酔をしたハエをコレクションケージに移し、ケージの開いた端に酵母ペーストの小さな塗りつぶしを入れた温めのリンゴジュース寒天プレートを置きます。その後、赤い袖でケージにプレートを固定します。古い胚を取り除くために、ハエがリンゴジュース寒天プレートに卵を25°Cで1時間産ませた。
インキュベーションの終わりに、ケージメッシュ側を下に反転し、ケージの底までハエをタップします。リンゴジュース寒天を新しい温め込んだリンゴジュース寒天プレートに、酵母ペーストの小さな塗りつぶしを入れ替えます。ハエが摂氏25度でさらに1時間、新しいプレートに卵を産むことを許可します。
注射のために後期17胚を収集するには、リンゴジュース寒天プレートを新しいプリウォームプレートに酵母ペーストのスミアで置き換えます。そして、ハエが摂氏25度でプレートに卵を産むことを許可します。1時間後、プレートを交換し、プレートを摂氏25度で19時間回収し、イメージング時に胚が20〜21時間古くなるように老化させます。
19時間のインキュベーションの終わりに、胚採取プレートをインキュベーターから取り出し、PbTxでプレートの表面を覆います。そして、胚を含むストレーナーを500ミリメートルのペトリ皿に5分間入れ、室温で時折攪拌してデコリオネートします。
インキュベーションの終わりに、新鮮なPbTxでストレーナーを渦巻いて、洗浄ごとに新しいペトリ皿を使用して胚を3回洗い流します。PbTxでストレーナーの片側に胚を洗い、ガラスピペットを使用して胚を2%アガロースゲルスラブに移します。余分な液体を濾紙で取り除きます。
スラブ上の6~8個の胚を右に後部に合わせ、後側を上に向け、胚の上のスライドに貼られた両面テープをしっかりと押します。その後、ハロカーボン油で標本を覆う前に、室温で約25分間胚を乾燥させます。幼虫のコレクションのために、所望の遺伝子型の5〜10の処女女性ハエとコーンミール寒天食品とバイアルで所望の遺伝子型の半分の男性と十字架を設定します。
25°Cで5〜7日後、遺伝子型に応じて、鉗子を使用してバイアルから3番目のインスター幼虫を静かに収集し、PBSで幼虫をすすいで詰め込んで詰まった食べ物を取り除きます。塗料ブラシを使用して組織の幼虫を乾燥させる前に、必要に応じてジェノタイピングのためにリンゴジュース寒天プレートに幼虫を移します。その後、鉗子を使用して、両面テープで準備されたスライドに6〜8匹の幼虫を移します。
注射の前に、マイクロピペットプーラーを使用して、D.メラノガスター注射用の標準的な針状に毛細管を引っ張り、ペトリ皿の粘土に針を固定します。胚注射の場合、20マイクロリットルのゲルローディングピペットチップを使用して、10キロダルトンデキストランを5マイクロリットルのコンジュゲートしてスルフォルホダミン101酸性塩化物に組み込み、針を針ホルダーにロードします。スチールベースに固定されたマイクロマニピュレータに針を置き、注入装置を1平方インチあたり50ポンド、10の範囲で5〜10ミリ秒に設定します。
マイクロマニピュレーターステージにスライドを置き、針の端を45度の角度で両面テープの端にブラシをかけ、開口部を通る10キロダルトンデキストランの流れを可能にするのに十分な角度の先端を作成します。染料が針の先端に入るまでフットペダルをポンピングします。針を胚と平行になるように合わせ、標本の後端を穿刺します。
足のペダルをポンプで送り、2ナノリットルの色素を試料に注入します。インキュベーション目的での注射時間に注意し、スライドを下に続けて追加の標本を注入します。幼虫注射の場合、胚を注入するために使用されるよりもわずかに大きな角度の開口部を作り、胚標本に示されたような220ナノリットルで幼虫を注入する前に、針を標本に向かってわずかに下方に傾けます。
10分間の注入インキュベーションの終わりに、綿の先端のアプリケーターを使用して、スライド上のサンプルの右側と左側にプロスペーサーとして石油ゼリーを塗布します。カバースリップを上に置き、スライドを共焦点顕微鏡ステージに置きます。20Xの目的を選択し、各胚の深さ全体のサンプルを画像化します。
次に、血液脳関門が損なわれたサンプルの割合を式に従って計算します。解剖手順を開始する前に、マニキュアを使用して、スライドの約0.5センチメートル離れた2つのカバースリップを取り付け、30分のインキュベーションの終わりにスライド上のPBSに注入した幼虫を置きます。1組の鉗子を使用して、幼虫の体の途中で幼虫をつかみ、2番目の鉗子を使用して幼虫の前部と後部の半分を分離する。
次に、1 組の鉗子を使用して口のフックで前領域を握り、2 番目の鉗子を使用して、最初の鉗子の先端にボディウォールを反転させます。脳と腹側神経コードが露出します.必要に応じて神経を切断することによって脳と腹側神経コードを体壁から分離し、スライドから体壁を取り除きます。
80%グリセロールの10マイクロリットルでサンプルをカバーします。次に、サンプルの上にカバースリップを置いてイメージングし、サンプルを画像化して、実証したように、侵害された血液脳関門を有するサンプルの割合を決定します。野生型後期17胚をスルフォルホダミン101酸性塩化物蛍光色素にコンジュゲートして10キロダルトンデキストランを注入すると、大きなデキストラン分子が予想通り腹側神経コードから除外される。
ヘテロ接合生1突然変異胚は、野生型対照胚で観察されたのと同様に、無傷の血液脳関門を示す。対照的に、ホモ接合性生1突然変異胚は、血液脳関門の完全性に欠陥を示し、10キロダルトンデキストランが腹側神経コードにあふれ、血液脳関門の障害を形成することを示す。野生型対照幼虫サンプルでは、10キロダルトンデキストランは血液脳関門に浸透せず、脳および腹側神経コードから除外される。
この手順を試みる場合、胚の適切な老化は、血液脳関門形成が完了すると予想される年齢でサンプルを検査するために重要である。この手順に従って、遺伝子、免疫体化学、および顕微鏡を用いて、遺伝子の血中脳関門を呈する変異体を研究し、細胞レベルでの遺伝子機能をよりよく理解することができる。この技術は、研究者が血液脳関門の確立と維持に不可欠な追加の遺伝子を同定することを可能にする。
