蛍光マクロスコピーを用いた無傷マウス頭蓋骨を介した脳脊髄液輸送の生体内イメージング

生きたマウスの無傷の頭蓋骨を通しての巨花性CSFのリアルタイムメソスコピックイメージングのためのこの新しい技術は、リンパ球輸送を評価するために使用することができる。主な利点は、この技術は、他のイメージングモダリティのコストのほんの一部でインビボイントラシトラサーナルトレーサーの動的測定を可能にすることです。シスターナマグナカニューレにヘッドプレートを置くために必要な手順は、シンプルで最小限の侵襲的ですが、正しく行われる練習が必要です。

この方法の重要なステップの視覚的なデモンストレーションは、画像品質を最大化し、異なるマウスと実験群の間で再現可能な比較を可能にするために必要とされます。つまみつまみへの応答の欠如を確認した後、滅菌水で首と頭を濡らし、湿らせた毛皮を剃る。露出した皮膚をアルコール綿棒で拭いて残った髪を取り除き、温度調節されたパッドの上の立体フレームにマウスを置きます。

動物の目に軟膏を塗布し、クロルヘキシジン綿棒で露出した皮膚をきれいにします。2分後にアルコール拭きでクロルヘキシジンを取り出し、ヨウドン溶液を塗布します。ヨウドンが乾燥すると、頭蓋骨と首の上部に皮下鎮痛を注入する。

後頭部の地殻を覆う首の部分から始めて、眼窩内線に向かってロスタルタルに続く上皮の中線切断を行う。側頭筋が頭蓋骨に挿入する境界まで切開を横方向に伸ばし、毛根切開の皮膚をすべて取り除き、前頭骨と頭頂骨の両方を露出させる。頭蓋骨を無菌生理的に灌漑し、綿棒を使用して、破片や髪がなくなるまで表面をきれいにします。

水槽マグナカニューレを挿入した後、国境の周りのヘッドプレートの腹側に歯科セメントとシアノアクリル接着剤の混合物を適用します。ヘッドプレートを頭蓋骨の上に置き、プレートの前部の境界が鼻骨の後端に合わせ、後方の境界が足頭間骨の前側面に合うようにして、矢状縫合が窓に対して真っ直ぐに中心になるようにします。ヘッドプレートが固定されていること、およびシステルナマグナカヌレーションの視野を妨げないようにすることが重要です。

ヘッドプレートの位置を固定し、セメント混合物で残りの隙間を埋めるために、接着剤の加速器の滴のカップルを使用してください。シスターナマグナカニューレをヘッドプレートに接着し、ヘッドプレートを使用してマウスをヘッドホルダーに固定された位置に配置します。慎重にマクロスコープに輸送するためのカートのカニューレに取り付けられたマウスと注入ポンプを置き、マクロスコープのステージにヘッドホルダーを置きます。

シリンジポンプからシステルナマグナカニューレまでのラインが張られていないこと、そしてキンクがないことを確認してください。粘液膜の呼吸数とピンク色を観察し、良好な酸素化を確認します。マクロスコープカメラと発光ダイオードをオンにして、ライブモードを開始します。

撮像フィールドの倍率を調整して、フィールド上部のナソフロント前頭縫合糸と底部のラムドイド縫合糸を明確に視覚化できるようにします。一度配置にヘッドホルダーをマクロスコープの段階にテープし、焦点面が冠状縫合糸の後部頭頂骨の側面に配置されるまで、露出した頭蓋骨にマクロスコープを集中させる。CSFトレーサーの注入のために注入ポンプを適切な速度および容積に設定し、各チャネルのためのトレーサーのための適切な励起波長および露出時間を設定する。

次に、トレーサー注入とイメージングを同時に開始する前に、マクロスコープのトリガ機能が正しいことを確認します。画像撮影中に、前頭、矢状、コロナ、およびラムドイド縫合糸を容易に同定することができる。CSFトレーサーがシステルナマグナに注入されると、蛍光のトレーサーは、松果部の近くのオルファト前頭前側の水槽と四頭側水槽のくも膜下CSFの大きなプールで最初に観察され、最終的には中大脳動脈を取り囲む。

CSFトレーサーは、その後、中大脳動脈の皮質孔枝の血管周囲空間に沿って脳に入る。外傷性脳損傷後のCSF輸送イメージングは、最初は嗅状前頭皮側のシステルでトレーサーを明らかにするが、皮質血管内空間に沿ったリンパ管の流入は傷害の側で完全に廃止される。インビボ画像での定量分析は、対角半球に比べて、周側流入領域が3分の1近く減少していることを示している。

動きのアーティファクトと焦点面の変化を避けるために、ヘッドプレートとヘッドプレートホルダーを正しく固定し、動物の麻酔レベルを確認してください。実験のインビボイメージングの結果は、実際のトレーサーの浸透を定量化することによってさらに検証することができこの技術は、生理学的かつ最小限の侵襲的な方法でリンパ系の研究を可能にし、健康と病気におけるCSF流体力学に関する将来の質問に対処するのに役立ちます。