このプロトコルは、シナプス前タンパク質がどこから生じたのか、すなわち細胞体または軸索を調べるのに適している。シナプス形成中にシナプス前タンパク質が組織化された方法でシナプス前に蓄積する方法。この技術は、同時に何千ものプレシナプスを誘導することができ、また、軸索中の多くの前シナプスの形成を効率的に分析することを可能にする培養中の軸索を維持するために特別な装置を使用しない。
大学院生の本見と共に、この手順をデモンストレーションするのは、私の研究室の学部生石井理です。テキスト プロトコルで説明されているように、マウス安楽死でこの手順を開始します。腹部を解剖してE16胚を得る。
細かい鉗子の助けを借りて慎重に胚から脳を取り除き、4ミリリットルのHEPES緩衝塩溶液またはHBSSを含む60ミリメートルの細胞培養皿に移します。髄を取り除き、嗅球を切ります。ステレオ顕微鏡下の鉗子の細かい先端を使用して各大脳半球から皮質を分離し、新鮮なHBSSを含む別の60ミリメートル皿に移す。
各別個のニューロンボール培養に対して、少なくとも3~5個の胚を使用する。層流細胞培養フードにスプリングハサミをマイクロディス分けして皮質を小さく切ります。今度は、ひき皮を15ミリリットルのチューブに移します。
37°Cの水浴で4.5分間HBSSで0.125%トリプシンの4ミリリットルのひき皮をトリプシン化する。細胞凝集体を、無菌移動ピペットにより10ミリリットルのHBSSを含む新しい15ミリリットルチューブに移します。このステップをもう一度繰り返す前に、摂氏37度で5分間インキュベートします。
次に、NGB培地、0.01%DNase I、および10%馬の血清を含む新しい15ミリリットルチューブに細胞凝集体を移します。火で磨いた細かいガラスのパスツールピペットを使用して3〜5回繰り返しピペットを作ってトリプシン化した皮質をトリチューレートします。ニューロンボールを調製するには、NGB培地を用いて細胞懸濁液中の細胞密度を1ミリリットル当たり100万個の細胞に調整します。
培養皿の底部に7ミリリットルのPBSを加えます。皮質ニューロンを10センチメートル培養皿の上蓋内に1滴当たり10,000個の細胞を含む10マイクロリットルの吊り下げ滴として培養する。ニューロンボールの形成を可能にするために加湿条件下で5%CO2で摂氏37度で3日間インキュベーターに料理を保管してください。
ポリL-リジンまたはPLLを、ホレートバッファーで1ミリリットルPLL溶液あたり15マイクログラムを使用して、60ミリメートルの皿のパラフィンビーズガラスカバースリップにコーティングします。CO2インキュベーターで摂氏37度で少なくとも1時間保管してください。PBSで4回洗浄した後、PLLコーティングされたカバースリップを、各ウェルに3マイクロモルAraCを含む350マイクロリットルのNGB培地を含む4ウェルプレートに移します。
アラクは、分割細胞を殺すためにメディアに追加されます。PLLコーティングカバースリップを含む4ウェルプレートをCO2インキュベーターに含む4ウェルプレートを少なくとも20分間インキュベートし、ニューロンボールを転送する前に培地の温度が摂氏37度に達することを確認します。DIV 3では、ニューロンボールが非常によく形成されている場合、PLLコーティングされたカバースリップに転送します。
4ウェルプレートの中に、井戸ごとに5つのニューロンボールを追加します。DIV 11では、ストレプトアビジン被覆磁性粒子の懸濁液からマイクロ遠心チューブへの20マイクロリットルの移動が行われた。ネオジム永久磁石を取り付けた手作りの装置にビーズを固定化し、1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブでPBS-MCBCの100マイクロリットルで3回洗浄します。
ビーズからPBS-MCBCを完全に除去した後、洗浄されたビーズにLRRTM2ストックの所定の量を加える。摂氏4度で1~2時間、混合物をインキュベートする。インキュベーションに続いて、100マイクロリットルのPBS-MCBCでビーズを2回洗います。
その後、100マイクロリットルのNGB培地でビーズを洗います。ニューロンボール培養に適用するために、50マイクロリットルのNGB培地でLRRTM2ビーズを再中断します。今度は、ステレオ顕微鏡の下にカミソリの刃で45度の角度で黄色の先端の端をカットします。
黄色の先端をニューロンボールの細胞体領域に置き、吸引によって細胞体を取り除きます。LRRTM2を適用し、コントロールビーズをニューロンボール培養に適用します。次に、フェライト磁石を使用してニューロンボール培養のプレートの底にビーズを1分間沈め、シナプス前形成を開始します。
この手順では、すべてのビーズを同時にタッチダウンします。テキストプロトコルに記載されているようにビーズでシナプス前形成後のニューロンボール培養中のニューロンを固定および染色する。60X油浸漬レンズを使用して、冷却されたCCDカメラを使用して、反転蛍光顕微鏡で差動干渉コントラストと免疫蛍光画像をキャプチャします。
軸索内のシナプス前の免疫蛍光強度を測定します。ビーズに関心領域の免疫蛍光強度を使用してください。ビーズから20ミクロンに沿って、軸索強度で割ったオフビーズ領域強度を差し引いた。
背景の強度を差し引いた値。この比率強度は、タンパク質蓄積指数を提供する。LRRTM2ビーズで誘導されるプレシナプス中の特定のタンパク質の蓄積レベルを定量化するには、細胞体から離れた2つの視野以上の領域を常に選択する。
正確な測定のために、カバースリップごとに5つの異なる軸索フィールドを選択してください。ここに示されているのは、ニューロンボールの軸索の前シナプスにおけるMunc18-1の蓄積を誘発したDIV 11におけるニューロンボール培養へのLRRTM2ビーズの適用である。ニューロンボールの軸索上のビーズは、位相顕微鏡画像で見えます。
そして、免疫蛍光画像によってシナプス前タンパク質の蓄積が観察される。細胞体を除去した軸索においても、細胞体を持つニューロンボールの軸索と同様に、ビーズの下でMunc18-1の蓄積が観察された。軸索シートの周辺領域を高倍率対物レンズで解析した場合、vGlut1およびMunc18-1は、細胞体の有無にかかわらずビーズの下の軸索の前シナプスに明らかに蓄積した。
時間経過実験は、プレシナプスにおけるvGlut1の蓄積が30分で有意に増加したことを示した。一方、Munc18-1の蓄積は2時間で大幅に増加し始め、4時間で高原に達した。これらのデータは、シナプス小胞タンパク質vGlut1が活性ゾーンタンパク質Munc18-1よりも早くプレシナプスに蓄積することを示している。
Fmr1-KOニューロンのプレシナプスにおけるMunc18-1蓄積は、野生型のニューロンよりも1.5倍増加し、Munc18-1蓄積におけるFMRPの関与を示す。タンパク質合成阻害剤は、アニソマイシン、細胞体の有無にかかわらず軸索におけるMunc18-1蓄積を有意に抑制した。これは蓄積がタンパク質合成依存であることを示す。
火で磨かれた細かいガラスのパスツールピペットを使用してトリプシン化皮質をピペット化することは重要なステップです。実験者は、2〜3つの異なる直径で火磨きピペットを準備し、適切な直径のピペットを選びました。この手順を用いて、LRRTM2ビーズによって誘導されるプレシナプスからのシナプス放出は、ライブイメージングによって測定される。
この追加の方法は、軸索のタンパク質合成がシナプス放出の調節に関与しているかどうか答えるだろう.この方法を用いて、研究者は、シナプス前タンパク質が体系化された方法でシナプス前タンパク質に蓄積する方法と、シナプス前タンパク質の発生源の位置を調べます。
